TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt Department Ingenieurwissenschaften für Lebensmittel und biogene Rohstoffe Lehrstuhl für Brau- und Getränketechnologie Univ.-Prof. Dr.-Ing. Thomas Becker Diplomarbeit Einfluss unterschiedlicher Maischeverfahren auf die frühzeitige Flokkulation der Hefe, basierend auf dem Fermentationstest von Lake und Speers Influence of different mashing processes on yeast flocculation, based on the fermentation assay by Lake and Speers Zur Erlangung des akademischen Grades Diplom-Braumeister Eingereicht von: Betreut von: Eingereicht am: Dekant, Christian; Matr.-Nr.: 03666330; Studiengang: Brauwesen mit Abschluss Diplom-Braumeister Kaian Hoi M. Sc. 16.10.2018 Eidesstattliche Erklärung Ich versichere hiermit, dass ich, Christian Dekant, die hier vorliegende Arbeit selbstän- dig, nur unter Verwendung der angegebenen Quellen und Hilfsmittel sowie ohne fremde Hilfe, angefertigt habe. Des Weiteren erkläre ich mich damit einverstanden, dass meine Diplom-/Studienarbeit in das Archivsystem des Lehrstuhls für Brau- und Getränketech- nologie aufgenommen wird und bei Bedarf zu weiteren Forschungs- und Lehrzwecken sowie zur Öffentlichkeitsarbeit verwendet werden darf. Diese Arbeit wurde bisher noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Freising, den 10. Oktober 2018 ....................................................... Christian Dekant -I- Eidesstattliche Erklärung Vorwort Diese Diplomarbeit wurde im Zeitraum Mitte Juli bis Mitte Oktober am Lehrstuhl für Brau- und Getränketechnologie am Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Er- nährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München angefertigt. Viele Personen haben durch ihren Beitrag zum erfolgreichen Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Deshalb geht mein herzlicher Dank an: Herrn Univ.-Prof. Dr.-Ing. habil. Thomas Becker für die Möglichkeit diese Diplom- arbeit am Lehrstuhl für Brau- und Getränketechnologie anzufertigen und für die Mög- lichkeit die Labore und sonstige Infrastruktur zu nutzen. Frau M.Sc. Ka Ian Hoi für ihre engagierte Betreuung der Arbeit. Sie war in allen Pha- sen der Arbeit am kontinuierlichen Fortschritt interessiert und bei allen auftauchenden Fragen zur Diskussion bereit. Durch ihre exzellente Einarbeitung in die analytischen Methoden sorgte sie für einen reibungslosen Ablauf der Versuche. Nicht zuletzt mein Dank für die über viele Wochen gehenden „Spätschichten“, die sie für die abendliche Durchführung der Messungen als zweite Person im Labor einlegte. Sandra Duschl, Vincent Merkel und Teresa Polz für die Unterstützung bei den Ar- beiten im Mikrobiologie-Labor, sowie Monika Braasch und Stephanie Fechner für die Unterstützung bei den Zucker-Analysen. Matthias Rott für die Einweisung in die Versuchsdurchführung zur Analyse von Ara- binoxylan und Dr. rer. nat. Michael Kupetz für die Bereitstellung der dazugehörenden Excel-Maske zur Auswertung der Messergebnisse. Meinen Kommilitonen Felix Koschinksi für die reibungslose Zusammenarbeit bei der Hefepropagation. Herrn Dr.-Ing. Hannes Petermeier für wertvolle Tipps zur statistischen Beschreibung meines Datensatzes. Bestimmt nicht an letzter Stelle ein tiefes und herzliches Dankeschön an meine Eltern Monika und Peter, die mir durch ihre Unterstützung das Studium in Weihenstephan erst ermöglichten. Widmen möchte ich diese Diplomarbeit meiner Frau Jelena und unserem kleinen Sohn Dominik. Vielen Dank für euer Vertrauen und eure Liebe und für die Geduld, die ihr mir in den letzten Monaten entgegengebracht habt. - II - Vorwort Eidesstattliche Erklärung I Vorwort II Liste der Abkürzungen V 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung und Aufgabenstellung 2 3 Material und Methoden 9 3.1 Hefebehandlung............................... 9 3.2 Würzebereitung............................... 10 3.3 Maischverfahren............................... 12 3.4 Analytik................................... 15 4 Eigene Arbeiten 19 4.1 DefinitionvonstandardisiertenBedingungen . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.2 VerlaufderFermentationstests....................... 20 4.2.1 Qualitative Diskriminierung von PYF-positivem Malz . . . . . . 22 4.2.2 Ansatz I zur Quantifizierung: numerische Integration der Trü- bungswerte ............................. 23 4.2.3 Ansatz II zur Quantifizierung: Zeitpunkt maximaler Würzetrübung 25 4.2.4 Ansatz III: Vergleich der Flokkulationsphase in den Malztypen . 28 4.2.5 Vergleichstest mit in Malzextrakt propagierter Hefe . . . . . . . 28 4.3 EinfachzuckerundvergärbareZucker ................... 30 4.4 PH-Werte .................................. 32 4.5 LöslicherStickstoff ............................. 32 4.6 FreierAminostickstoff ........................... 34 4.7 β-Glucan................................... 35 4.8 MethodikderBestimmungvonArabinoxlan . . . . . . . . . . . . . . . 35 5 Schlussfolgerung und Ausblick 6 Literatur 7 Anhang 38 42 48 - III - Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis 3.1 Temperaturführungen der angewandten Maischverfahren . . . . . . . . 13 4.1 Zeitlicher Verlauf der optischen Dichte der Fermentationsversuche . . . 21 4.2 LOESS-Regression der Fermentationsversuche . . . . . . . . . . . . . . 26 4.3 ZuckergehaltederhergestelltenWürzen. . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 4.4 Variation der pH-Werte mit Malztyp und Maischverfahren . . . . . . . 33 4.5 GehalteanlöslichemStickstoffindenWürzen . . . . . . . . . . . . . . 33 4.6 VariationvonlöslichemStickstoff ..................... 35 4.7 Variationvonβ-Glucan........................... 36 7.1 Vergleich der Würzetrübung in PYF-negativen und PYF-positiven Wür- zenmittelst-Test.............................. 52 7.2 Gehalte von Glucose und Maltose, getrennt nach Maischverfahren und Malztyp................................... 57 Tabellenverzeichnis 2.1 Lektin-codierende Gene und zugehörige Phänotypen der Flokkulation . 4 3.1 ExtraktgehaltederhergestelltenWürzen . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 3.2 EnzymeimMalz .............................. 14 3.3 Verdünnung der Proben zur Bestimmung vergärbarer Zucker . . . . . . 18 4.1 TrübungderWürzenzut=0h....................... 20 4.2 Mittelwertvergleich (t-Test) der optischen Dichte von PYF-negativem undPYF-positivemMalzbeit=48hundt=72h . . . . . . . . . . . . . 22 4.3 Quotienten der Flächen der durch die Messpunkte der Würzetrübung aufgespanntenFlächen ........................... 24 4.4 ZeitpunktdermaximalenTrübungderWürzen . . . . . . . . . . . . . 27 4.5 AbfallderTrübunginderFlokkulationsphase . . . . . . . . . . . . . . 28 7.1 Trübungsmessungen der Fermentationsversuche . . . . . . . . . . . . . 48 7.2 AnalysenderZuckergehalte ........................ 53 7.3 Analysen von FAN, löslichem Stickstoff und β-Glucan . . . . . . . . . . 55 - IV - Abbildungsverzeichnis Liste der Abkürzungen ◦ ◦ C ◦ P % C O2 FAN g h ml nm PYF rpm YEPD μl Grad Grad Celsius Grad Plato Prozent Kohlendioxid free amino nitrogen, freier Aminostickstoff Gramm Stunde Milliliter Nanometer premature yeast flocculation, vorzeitige Hefeflockung Umdrehungen pro Minute yeast extract peptone dextrose, Hefeextrakt-Pepton-Dextrose Microliter -V- Liste der Abkürzungen 1 Zusammenfassung -1- 1 Zusammenfassung 2 Einleitung und Aufgabenstellung Die Herstellung von Bier ist der einzige großindustrielle Herstellungsprozess eines alko- holischen Getränks, bei dem die zur Vergärung eingesetzte Hefe wiederverwendet wird [1]. Dementsprechend kritisch ist die Qualität (Viabilität, Vitalität und Reinheit) der Erntehefe zu überwachen, da sie entscheidenden Einfluss auf die Bierqualität nachfol- gender Chargen hat [2]. Stewart et al. [3] definieren die Ansprüche, die der Brauer an seine Hefe stellt, als die Fähigkeit die in der Würze enthaltenen Nährstoffe zu meta- bolisieren, die vorherrschenden Umweltbedingungen zu tolerieren (osmotischer Druck, Ethanol, CO2) und das gewünschte Aroma zu entwickeln. Nach erfolgreicher Fermen- tation muss meist aber auch die Hefe selbst durch Sedimentation, Zentrifugation und Filtration wieder aus dem Jungbier entfernt werden, wenn es sich nicht um ungefilterte Biere wie z.B. naturtrübe Kellerbiere oder ähnliche Bierstile handelt. Einen kaum hoch genug einzuschätzenden Beitrag zur effektiven Abtrennung der He- fe vom Jungbier leistet dabei der Vorgang der Flockenbildung. Zur Flockenbildung von Hefe, auch als Flokkulation oder Bruchbildung bezeichnet, kommt es, wenn sich einzelne Hefezellen zu flockigen Aggregaten oder Filmen von mehreren tausend Zellen zusam- menlagern und entweder aus dem Medium, in dem sie suspendiert sind, ausfallen oder zu dessen Oberfläche aufsteigen [4]. Dieser Prozess beginnt normalerweise gegen Ende der Primärgärung, wenn die in der Bierwürze enthaltenen Nährstoffe bereits größtenteils von der Hefe verzehrt worden sind [5]. Die Größe der gebildeten Agglomerate wirkt sich auf die Sedimentationsgeschwindigkeit und damit die Effizienz des Trennungsprozesses der Hefezellen vom Jungbier aus [6]. Deshalb ist eine möglichst vollständige und stark ausgeprägte Flockenbildung wünschenswert, da sie einen einfachen, umweltfreundlichen und quasi kostenfreien Weg darstellt, die Hefe nach Ende der Primärgärung wieder aus dem Bier zu entfernen [7]. Der Zeitpunkt, zu dem die Flockenbildung einsetzt, ist von entscheidender Bedeu- tung. Erfolgt die Flockenbildung sehr langsam oder spät (der Brauer spricht in diesem Fall von Staubhefe) sind hohe Hefegehalte im Lagerbier und damit Filtrationsprobleme die Folge. Entsprechend sind längere Standzeiten für die natürliche Bierklärung oder verstärkter Aufwand zur künstlichen Klärung des Bieres mittels Klärungsmittel oder Zentrifugation einzuplanen, um negative Einflüsse auf die Bierqualität wie hefigen Ge- schmack oder im schlimmsten Fall Autolyseprodukte zu vermeiden [8]. Bei frühzeitiger -2- 2 Einleitung und Aufgabenstellung Flokkulation der Hefe, englisch premature yeast flocculation (PYF), kann es andererseits zu Gärstockungen oder zu einem frühzeitigen Abbruch der Gärung kommen. Dadurch erreicht das Bier nur unzureichende Endvergärungsgrade und besitzt aufgrund noch vorhandener vergärbarer Zucker unerwünschte Restsüße, die auch mikrobiologische An- fälligkeit nach sich ziehen kann [9]. Außerdem kann sich PYF negativ auf die sensori- schen Eigenschaften des fertigen Biers auswirken, z.B. durch erhöhte Diacetylgehalte [10] Die biochemischen Mechanismen, die bei der Flockenbildung von Hefe wirken, sind grundlegend erforscht. Nach der weitgehend anerkannten Lektin-Theorie der Flocken- bildung von Miki et al. [11] sondern flokkulierende Hefen spezifische Proteine (Lektine) in die äußere Schicht ihrer Zellwände ab. Diese Lektine binden selektiv an Mannose- reste, die sich in der Zellwand benachbarter Zellen befinden. Calziumionen werden für diesen Prozess benötigt, um die Lektine in eine aktive Konformation zu bringen [12]. Da Mannosereste in allen Hefezellwänden vorhanden sind, und dort etwa 10-20% der Polysaccharidfraktion ausmachen, ist der auslösende Faktor für die Flockenbildung das Vorhandensein von Lektinen [13]. Auf genetischer Ebene werden die Flokkulationseigenschaften von Hefen von einer Familie von Genen reguliert, die als FLO-Gene bezeichnet werden. Das erste Flokku- lationsgen in S. cerevisiae, FLO1, wurde bereits 1976 von Lewis et al. [14] im Detail untersucht. Seitdem wurden mindestens neun Gene identifiziert, die für die Kodierung von Lektinen zuständig sind [15]. Berücksichtigt man neben den Lektin-kodierenden Genen der FLO-Familie noch Gene, die bei filamentösem Wachstum und Adhäsion an festen Oberflächen eine Rolle spielen, Transkriptionsfaktoren, die die Genexpression der FLO-Gene regulieren, sowie Gene, die für Zellwandsynthese verantwortlich sind, so wurden von Teunissen und Steensma [16] insgesamt 33 Gene aufgeführt, die die Flokkulation und Zellaggregation steuern. Basierend auf der reversiblen Hemmung der Flokkulation bei Zugabe verschiedener Zucker und Kationen ins Fermentationsmedium konnten zwei hauptsächliche Phänotypen der Flokkulation unterschieden werden [17]: Flo1 und NewFlo. Phänotyp Flo1 beinhaltet Hefestämme deren Flokkulation spezifisch durch Zugabe von Mannose ins Fermentationsmedium gehemmt wird. Der Phänotyp NewFlo beinhaltet dagegen Hefestämme bei denen die Flokkulation zusätzlich durch Zugabe von Maltose, Glukose oder Saccharose gehemmt wird. Die (reversible) Hem- mung der Flockenbildung wird mutmaßlich dadurch herbeigeführt, dass die freien im -3- 2 Einleitung und Aufgabenstellung 2 Einleitung und Aufgabenstellung Medium vorhandenen Zucker die Bindungsstellen der Lektine besetzen und diese dann nicht mehr als Bindungsstellen für Nachbarzellen zur Verfügung stehen [7]. Zwei wei- tere Phänotypen wurden beschrieben: der M1-Phänotyp, bei dem die Flockenbildung nicht durch Zugabe von Zucker (einschließlich Mannose) gehemmt wird [18] und ein Phänotyp bei dem Flokkulation nur in Gegenwart hoher Konzentrationen von Ethanol stattfindet [19]. Ein Überblick über die Phänotypen der Flokkulation ist in Tabelle 2.1 gegeben. Tabelle 2.1: Überblick über die bislang bekannten Lektin-codierenden Gene und die den entsprechenden Phänotyp der Flokkulation inhibierenden Zuckerarten nach [15]. Gene FLO1, FLO5, FLO9, FLO10 FLO8 Lg-FLO1 FLO11 FLONL, FLONS Unbekannt Phänotyp Flo1 Regulation von FLO-Genen NewFlo Pseudohyphen, Anhaftung Ähnlich NewFlo M1 — Mannose/Calzium insensitiv Inhibierende Zucker Mannose Nicht zutreffend Mannose, Glukose, Saccharose, Mal- tose, Maltotriose Nicht bekannt Mannose, Glukose, Saccharose, Mal- tose, Maltotriose, Galaktose Nicht bekannt Die Umweltfaktoren, die neben dem genetischen Hintergrund auf die Flokkulation von Hefe einwirken sind vielfältig, komplex und in manchen Fällen sogar unklar [7, 20, 21]. Generelle Übereinkunft herrscht über die Tatsache, dass Flokkulation durch einen Mangel an Nährstoffen oder andere Stressfaktoren hervorgerufen werden kann [7, 8, 22]. Flockenbildung kann die Überlebenschancen von Hefezellen während widriger Bedin- gungen begünstigen [23], da z. B. bei mangelnder Nährstoffversorgung die Aggregation von Hefezellen einen entscheidenden Vorteil bietet: durch Tod und Autolyse einzelner Hefezellen werden Stoffe freigesetzt, die den benachbarten Zellen dann zur Verfügung stehen [24]. So wurde nachgewiesen, dass auch Hefestämme mit ausgeprägten Flokku- -4- 2 Einleitung und Aufgabenstellung lationseigenschaften diese Eigenschaften in Gegenwart von Nährstoffen verloren und erst gegen Ende des exponentiellen Wachstums, einhergehend mit zunehmendem Nähr- stoffmangel wieder erlangten [22]. Weitere Faktoren, die sich auf die Flokkulation der Hefe auswirken können, sind die Belüftung der Würze, die Fermentationstemperatur, der pH-Wert, der Alkoholgehalt, Zellgröße und -alter, Hefemanagement (Hefewaschen, Hefeernte, Lagerung) und Anzahl der Führungen [7]. Schließlich spielen noch physi- kalische Faktoren bei der Flockenbildung eine Rolle. Es wurde beobachtet, dass die Hydrophobizität der Zelloberfläche, welche eine Annäherung von Hefezellen begünstigt, bei einsetzender Flokkulation zunimmt [23, 25, 26, 27]. Die niedrigere Hydrophobizität der Zelloberfläche in der exponentiellen Wachstumsphase einer Hefekultur führen Powell et al. [28] auf den Anteil an jungen Tochterzellen zurück, die eine signifikant niedrigere Hydrophobizität besitzen als ältere Zellen. Korrelierend mit einer stärkeren Expression von FLO-Genen konnte außerdem ein signifikanter Anstieg der Oberflächenhydropho- bizität nachgewiesen werden [29]. Ein klarer Einfluss der negativen Oberflächenladung, welche einer Annäherung von Hefezellen entgegenwirkt, auf die Flokkulation konnte nicht nachgewiesen werden [19, 26]. Während, wie diskutiert, eine möglichst intensive Flockenbildung gegen Ende der Primärgärung ein wünschenswerter Vorgang ist, wird seit den 1950er Jahren von Malz- chargen berichtet, bei denen es zu vorzeitiger oder starker Ausflockung der Hefe ge- kommen ist [30]. Der Vorgang, bei dem Hefezellen frühzeitig aus der Würze ausflocken, wird als premature yeast flocculation (PYF) bezeichnet und tritt sporadisch in Zusam- menhang mit spezifischen Malzchargen auf [31]. An einer einheitlichen Definition des Phänomens mangelt es bislang in der Fachliteratur [31]. Es ist hier Vorsicht angebracht, um nicht irrigerweise eine unbefriedigend verlaufende Fermentation als PYF zu klassi- fizieren, die sich auf Ursachen wie niedrige Sauerstoff- oder Biotingehalte, zu niedrige Anstellzellzahlen oder geringe Hefevitalität zurückführen ließe [31]. Als Grundlage für eine Definition von PYF geben Lake und Speers [31] zwei Charakteristika an, die sich bei der Fermentation von PYF-positivem Malz beobachten ließen: 1.) eine rapide Abnahme von suspendierten Hefezellen in der Würze nach Erreichen der maximalen Zellzahl, die einen konkaven Kurvenverlauf der Zellzahl gegen die Fermentationsdauer bildet und 2.) gelegentlich einen höheren scheinbaren Restextrakt im Vergleich zu PYF-negativen Malzen. Definitionsgemäß stammen die sogenannten PYF-Faktoren aus dem Malz [31]. Das -5- heißt, die betreffenden Verbindungen im Malz müssen in der Lage sein, den Brau- prozess in einer aktiven Konformation zu überstehen, um während der Fermentation ein frühzeitiges Ausflocken der Hefezellen zu bewirken. Bemühungen um die Identifi- zierung PYF-induzierender Verbindungen im Malz fanden Substanzen, bei denen es sich großteils um stabile Polysaccharide und Glycoproteine handelt [7]. Die frühesten Untersuchungen zum Thema in den späten 50er Jahren fanden eine huminsäurearti- ge Verbindung, die durch saure Hydrolyse aus Trebern gewonnen wurde [32]. Bei den gefundenen Polysacchariden handelt es sich um hochmolekulare Hemicellulosen mit wechselnden Anteilen von Arabinose, Xylose, α-Glucan, Mannose, Galaktose, Glucose und Rhamnose [33, 34, 35, 36, 37]. Zwei weitere Substanzen, die mit dem Auftreten von PYF assoziiert werden, enthalten Stickstoff, weswegen sie als Glycoproteine klassi- fiziert werden [38, 39]. Bei den gebundenen Zuckerresten handelt es sich um Arabinose, Xylose, Mannose, Galaktose und Glucose. Die Zugabe von Pronase verursacht bei die- sen Substanzen allerdings keine Reduktion der PYF-Aktivität, woraus zu schließen ist, dass der Proteinrest des Moleküls nicht direkt an der PYF-Aktivität beteiligt ist [39]. Pronase ist eine kommerziell erhältliche Mischung aus unspezifisch wirkenden Endo- und Exopeptidasen, die aus der extrazellulären Flüssigkeit von Streptomyces griseus gewonnen wird und native Proteine vollständig in einzelne Aminosäuren spaltet [40]. Ein Einfluss auf die Flockenbildung durch aus Gerste stammender Lektine konnte nicht bestätigt werden [41]. Die Hypothese, dass antimikrobielle Peptide, insbesondere Lipid- transferproteine aus der Gerste, Einfluss auf die Hefeflockung haben, konnte ebenfalls nicht bestätigt werden [31, 42]. Trotz der Vielfalt der gefundenen Strukturen (die sich teils durch unterschiedliche Vorgehensweisen bei der Probenvorbereitung erklären lassen [31]) kann man also als mutmaßlichen Kandidaten für den PYF-Faktor ein hochmoleku- lares Polysaccharid auf Arabinoxylan-Basis mit Peptidkomponente(n) postulieren [31]. Zwei Theorien zur Entstehung von PYF-Faktoren werden in der Literatur angeführt. Bei der Erforschung nach der Ursache für die Bildung von PYF-Faktoren kann man zu- nächst feststellen, dass das Phänomen PYF nur sporadisch und gehäuft in regnerischen und feuchten Jahrgängen auftritt, in denen die Gerste erhöhter mikrobieller Belas- tung ausgesetzt ist [9]. Die erste Theorie macht verstärkte mikrobielle Besiedelung der Gerstenspelze für die Produktion von PYF-Faktoren verantwortlich [36]. Panteloglou [43] erklärt die Bildung von PYF-Faktoren, insbesondere bei verstärktem Pilzbefall der Gerste, durch enzymatischen Abbau der Spelze, bei der hochmolekulare Polysaccharide -6- 2 Einleitung und Aufgabenstellung entstehen. Dass antimikrobielle Peptide, die die Gerste bei Infektionen produziert, für PYF verantwortlich gemacht werden können, ist bisher nicht bewiesen [31, 42]. Eine zweite Theorie erklärt das Auftreten von PYF durch Stress, der in der Mälzerei bei er- höhtem Druck während der Weichphasen auf die Gerste einwirkt. Ein Zusammenhang zwischen erhöhtem Druck während der Weichphasen zu schlechter gelösten Malzen und Auftreten von PYF konnte gezeigt werden [44], wobei Lake und Speers [31] bemer- ken, dass sich ein entsprechendes Fermentationsprofil eventuell auch auf die schlechtere Malzqualität zurückführen lasse. Es herrscht also sowohl bezüglich einer definierten Substanz im Malz, eines PYF- Faktors, der eine frühzeitige Flockenbildung der Hefe auslöst, ebenso wie bezüglich der zugrunde liegenden biochemischen Mechanismen, die durch solch eine Substanz aus- gelöst werden noch weitgehend Unklarheit. Die standardmäßig an Braumalz durchge- führten Analysen erlauben keine Vorhersagen über das Auftreten von PYF, eine Un- tersuchung des Phänomens muss mittels eines Fermentationstests geschehen [45]. Trotz potentiell großer finanzieller Schäden, die eine frühzeitige Flockung von Hefe für ei- ne Brauerei anrichten kann, gibt es bis dato noch keinen allgemein anerkannten und standardisierten Versuchsaufbau zur Messung des Phänomens [8]. Basis für die Un- tersuchungen des Flokkulationsverhaltens in dieser Arbeit stellt der kleinmaßstäbliche Fermentationstest von Lake et al. [46] dar. Dieser Fermentationstest kann in Reagenz- gläsern mit einem Würzevolumen von 15 ml durchgeführt werden. Gegenüber Versuchs- anordnungen in größeren Gefäßen bringt dies erhebliche Einsparungen an Arbeitszeit, Labor- und Materialkosten mit sich. Durch Etablierung dieses Fermentationstests kann so in der Praxis zeitnah – durch Maßnahmen wie Verschnitt des Malzes mit PYF- negativen Chargen [47] oder waschen des Malzes vor dem Schroten [42, 48] – reagiert werden. Außerdem kann erwartet werden, dass ein reduziertes Probevolumen die PYF- Forschung wesentlich unterstützt. Abgesehen von kleineren, praktisch bedingten Mo- difikationen wird der experimentelle Aufbau von Lake et al. [46] in allen wesentlichen Punkten strikt eingehalten. Die grundlegende Aufgabenstellung der vorliegenden Diplomarbeit ist es, den Einfluss unterschiedlicher Temperaturführungen beim Maischprozess auf das Flockungsverhal- ten der Hefe zu untersuchen. Durch spezifische Temperaturführungen sollen hierbei die Aktivitäten von amylolytisch, cytolytisch und proteolytisch wirkenden Enzymen geför- dert und so entsprechend die Wuchs- und Nährstoffzusammensetzung der jeweiligen -7- 2 Einleitung und Aufgabenstellung Würze eingestellt werden. Dabei wird an vorangegangene und zeitgleich stattfindende Arbeiten am Lehrstuhl angeschlossen. Aus der Aufgabenstellung ergeben sich mehrere zu bearbeitende Themen- und Fra- genkomplexe: Zum einen soll durch Verbreiterung der verfügbaren Datenbasis zum Flockenbildungs- verhalten von Hefe mittels eines kleinmaßstäblichen Fermentationstests nach Lake et al. [46] ein Beitrag zur Etablierung eines Standardtests für PYF geleistet werden. Hier- bei ist von Interesse, ob der Fermentationstest eine grundsätzliche Diskriminierung von PYF-positivem Malz auch bei Veränderung des Fermentationsmediums erlaubt. Durch Korrelation der quantitativen Intensität der Flockenbildung zu verschiede- nen Würzeparametern (FAN, löslicher Stickstoff, β-Glucan, Arabinoxylan, Gehalte an vergärbaren Zuckern) soll herausgearbeitet werden, inwieweit durch ein angepasstes Maischverfahren die Flockenbildung der Hefe beeinflusst werden kann bzw. ob die un- tersuchten Substanzen in ursächlichen Zusammenhang mit der Intensität von PYF ge- bracht werden können. Schließlich stellen sich Fragen zur praktikablen Anwendung der Ergebnisse, zum Einen, ob sich bestimmte Maischverfahren besonders gut eignen um PYF-positives Malz zu unterscheiden. Zum anderen, ob sich Empfehlungen für bestimmte Maisch- verfahren aussprechen lassen, durch deren Anwendung sich der Effekt von PYF in der Brauereipraxis in gewissem Rahmen unterdrücken lässt. -8- 2 Einleitung und Aufgabenstellung 3 Material und Methoden Die im Rahmen dieser Untersuchung durchgeführten experimentellen Arbeiten wurden in den Mikrobiologie-Laboren des Internationalen Getränkewissenschaftlichen Zentrums Weihenstephan und im Prüflabor bzw. Praktikumslabor des Lehrstuhls für Brau- und Getränketechnologie der Technischen Universität München am Wissenschaftszentrum Weihenstephan durchgeführt. 3.1 Hefebehandlung Die hier beschriebenen Vorgehensweisen folgen, abgesehen von geringfügigen, praktisch bedingten Modifikationen, der Vorgehensweise in [46]. Hefekultur Für alle Fermentationstests wurde der Hefestamm W34/70 der Hefebank Weihenste- phan verwendet. Bei W34/70 handelt es sich um eine untergärige Bierhefe (Saccharomy- ces pastorianus ssp. carlsbergensis) mit guten Bruchbildungseigenschaften. Sie erreicht mittlere bis hohe Ausstoßvergärungsgrade von ca. 78–81%. Die Stammhaltung der Hefe erfolgte auf YEPD-Agarplatten (yeast extract peptone dextrose) der Zusammensetzung 2% Dextrose (VWR, Darmstadt), 2% Trypton (Pep- ton aus Casein) (VWR, Darmstadt), 1 % Hefeextrakt (Merck, Darmstadt) und ca. 20 % Agar (MARKE). Die YEPD-Agarplatten wurden aerob bei 28◦C für 48h inkubiert. Danach wurden sie mit Parafilm versiegelt und bei 0–4◦C gelagert. Nach zwei Monaten wurde eine neue Stammkultur auf einer frischen Agarplatte kultiviert. Hefepropagation und -ernte Kolonien von der YEPD-Agarplatte wurden aseptisch in Reagenzgläser übertragen, die etwa 15ml YEPD-Bouillon enthielten (Zusammensetzung: 2% Dextrose (VWR, Darmstadt), 2% Trypton (Pepton aus Casein) (VWR, Darmstadt), 1% Hefeextrakt (Merck, Darmstadt)). Die Reagenzgläser wurden für 24 h bei 28◦C inkubiert. Die weitere Propagation erfolgte in zwei Stufen ebenfalls in YEPD-Medium, unter Zugabe von jeweils 100 ml YEPD für 48–72 h bei Raumtemperatur, unter aeroben Bedingungen auf einem Schütteltisch bei 100 rpm. Zu Vergleichszwecken wurde außerdem für das Hochkurz-Maischverfahren neben der -9- 3 Material und Methoden Propagation in YEPD noch eine Hefepropagation in mit auf 10◦P eingestelltem Malz- extrakt aus Pilsener Malz (Weyermann, Bamberg) durchgeführt. Nach der Propagation wurde die Hefesuspension zentrifugiert (5min bei 5000rpm, Beschleunigung etwa 2800 m/s2) und mit sterilem deionisiertem Wasser gewaschen. Die- ser Prozess wurde dreimal wiederholt (3min bei 5000rpm). Nach dem letzten Wasch- vorgang wurde der Hefepressling wieder in sterilem, deionisiertem Wasser suspendiert [46]. Zellzahlbestimmung Je nach Dichte der Hefesuspension wurde mit 0,2N Natriumacetat-Pufferlösung mit 10 mM EDTA und pH 4,4 eine 1:100 bis 1:200fach verdünnte Lösung hergestellt. Die Auszählung erfolgte unter dem Mikroskop mit einer Thoma-Kammer (0,100 mm Tiefe, 0,0025 mm2 Fläche, Auszählung von 32 Großquadraten), gemäß der MEBAK-Methoden (Brautechnische Analysemethoden Band III) 10.11.4.4 und 10.11.4.4. 3.2 Würzebereitung Die Zubereitung der Würzen erfolgte mit einem Labor-Maischbad (Dinkelberg Analy- tics, Gablingen). Es wurden für jedes durchgeführte Maischverfahren und jeweils für PYF-positives und PYF-negatives Malz eine Maischebereitung in drei separaten Mai- schebechern durchgeführt. Malz Für jeden Fermentationsversuche wurden je ein PYF-positives und ein PYF-negatives Pilsener Malze identischer Sorte verwendet, die sich nur durch unterschiedliche Mäl- zungsbedingungen auszeichnen. Auf einen Ausweis von Sorte und Hersteller wird hier ausdrücklich verzichtet um Rufschädigung zu vermeiden. Maischbad Malz wurde in einer Labormühle (HERSTELLER, ADRESSE) bei einer Spaltweite von 0,2 mm gemahlen. Jeweils 50 g Malz wurden auf 0,01 g genau in einen Maischebe- cher eingewogen und mit 350 ml auf Einmaischtemperatur vorgewärmtem, deionisiertem Wasser aufgegossen. Nach Durchlauf der spezifischen Temperaturführung des jeweili- gen Maischprogramms (siehe Kapitel 3.3) und Erreichen der Endtemperatur wurde die - 10 - 3 Material und Methoden Maische auf 20◦C abgekühlt und die Würze vom Treber über Filterpapier abgefiltert, wobei die ersten 50 ml Trübwürze wieder auf den Treberkuchen zurückgegossen wurden. Die aufgefangene Würze wurde für 20min gekocht und mit deionisiertem Wasser auf 11,1◦P±5% eingestellt, die Extraktgehalte der Würzen sind in Tabelle 3.1 gegeben. Die Messung des Extraktes der Stammwürze erfolgte mit einem Biegeschwinger (Anton Paar, Graz, Österreich) nach der Kochung sowie zur Kontrolle nach Rückverdünnung der Würze. Die Würze wurde 20min bei 121◦C autoklaviert und bei 14◦C für maximal 7 Tage gelagert. Tabelle 3.1: Extraktgehalte der hergestellten Würzen, alle Zahlenangaben in scheinba- rer Extrakt in [◦ Plato] 3 Material und Methoden Maische I65 PYF-negativ-I 11,51 PYF-negativ-II 11,37 PYF-negativ-III 11,45 PYF-positiv-I 11,52 PYF-positiv-II 11,32 PYF-positiv-III 11,42 HK-M HK HZ E35 E45 11,68 11,60 11,33 11,42 11,55 11,51 11,43 11,44 11,31 11,33 11,50 11,42 11,37 11,42 11,37 11,33 11,39 11,39 11,24 11,35 11,39 11,44 11,45 11,45 11,34 11,43 11,44 11,29 11,29 11,41 Eyben LuS 11,60 11,61 11,35 11,48 11,45 11,42 11,40 11,46 11,35 11,44 11,38 11,51 Zugabe von Glucose, Würzebelüftung und Anstellen Vor dem Anstellen wurden 4% D-(+)-Glucose (HERSTELLER, ADRESSE) in der Anstellwürze gelöst, eine Belüftung der Würze fand dabei implizit durch Schütteln und Umfüllen der Flüssigkeit statt. Die Würze wurde mit Hefezellzahlen von 1, 5 · 107 Zellen/ml angestellt. Für jeden hergestellten Würzebecher (je drei pro Maischverfah- ren und PYF-positives/-negatives Malz) wurden dann 15 ml Würze in dreifachem An- satz in Reagenzgläsern angestellt, die Würzehöhe zu Versuchsbeginn betrug dabei etwa 12 cm. Insgesamt bestand die Versuchsdurchführung damit aus je neun Reagenzgläsern pro Malztyp. Die Proben wurden bei 20◦C fermentiert. Die Notwendigkeit der Zugabe von Glucose und der hohen Fermentationstemperatur ergibt sich aus der Notwendig- keit bei Miniaturisierung des Versuchsaufbaus (und des daraus resultierenden niedrigen Würzestandes im Fermentationsgefäß), eine Mindestscherrate im Medium aufrechtzuer- halten, um eine zu schnelle Sedimentation der Hefezellen auch in PYF-negativem Malz - 11 - zu verhindern [46, 48]. Um einen Fermentationstest erfolgreich in einem Reagenzglas mit 15 ml Volumen durchzuführen und dabei Kontrollmalz von PYF-positivem Malz zu unterscheiden ermittelten Lake et al. eine notwendige Mindestscherrate von 4-7.5 sec−1. Durch entsprechende Gehalte an Angärzuckern und die dadurch erzeugte Turbulenz durch aufsteigende CO2-Bläschen wird damit sichergestellt, dass Hefezellen nicht durch reguläre Sedimentation aus dem Fermentationsmedium ausfallen und somit eine er- folgreiche Unterscheidung zwischen PYF-positivem und PYF-negativem Malz erfolgen kann [46]. 3.3 Maischverfahren Zum Nachweis auf Unterschiede des Flockungsverhaltens der Hefe wurden insgesamt sieben verschiedene Maischprogramme durchgeführt, einen graphischen Überblick über die dabei durchlaufenen Temperaturprogramme gibt Abbildung 3.1. Das Hochkurz- Maischverfahren wurde mit identischer Temperaturführung zweimal angewandt, wobei im Wiederholungsversuch die Hefe nicht wie in [46] in YEPD sondern in Malzextrakt propagiert wurde, siehe Kapitel 3.1. Möglicherweise kann sich hier für weiterführende Arbeiten ein Arbeitsansatz ergeben, der aus unterschiedlicher Adaption der Hefe an das Propagationsmedium herrührt und auch praxisnähere Bedingungen schafft. FORMU- LIERUNG Durch Unterschiede in der Temperaturführung des Maischprogramms sollten mögli- che Unterschiede im Flockungsverhalten der Hefe bei der Fermentation herausgearbeitet werden, da sich die erzeugten Würzen in ihrer Zusammensetzung aufgrund unterschied- licher Aktivität verschiedener Enzyme im Malz unterscheiden, siehe hierzu Tabelle 3.2. Eine einfache Einteilung der Würzen in zwei Gruppen bietet sich an. Mit der Iso- thermen 65◦C, der Hochkurz- und der Hochzucker-Maische handelt es sich um Maisch- programme die in Labor- und Industriepraxis gebräuchlich sind und vor allem amyloly- tische Lösevorgänge begünstigen. Bei einem Bereich der Temperaturführung zwischen 62◦C bis 72◦C sind bei diesen Masichverfahren die Aktivitäten der β- und α-Amylasen betont, bei gleichzeitiger Inaktivierung fast aller Enzyme des cytolytischen und pro- teolytischen Spektrums. Die zweite Gruppe von Maischverfahren (35◦C-Maische, 45◦C- Maische, Eyben-Maische und das Maischverfahren nach Lake et al.) betonen mit Tem- peraturrasten von 35◦C und 45◦C die Aktivitäten von cytolytisch und proteolytisch wirkenden Enzymen, sodass in diesen Würzen tendenziell höhere Gehalte an Peptiden - 12 - 3 Material und Methoden ABEF 3 Material und Methoden 100 75 50 25 0 100 75 50 25 CDGH 0 0 50 100 1500 50 100 1500 50 100 1500 50 100 150 Zeit [min] Abbildung 3.1: Temperaturführungen der angewandten Maischverfahren. A: Isothermes 65◦C-Maischverfahren, B, C: Hochkurz-Maischverfahren, C: Hochkurz-Maischverfahren, D: Hochzucker-Maischverfahren, E: 35◦C-Maischverfahren, F: 45◦C-Maischverfahren, G: Eyben-Maischverfahren, H: Maischverfahren nach Lake et al. [46]. und freien Aminosäuren zu erwarten sind. Maischverfahren nach Lake et al. [46] Als Referenzverfahren und zu Vergleichszwecken wurde das Maischprogramm aus Lake et al. [46] verwendet. Die Einmaischtemperatur von 45◦C wurde für 30min gehalten, danach wurde die Maische bei einer Rate von 1◦C/min auf 70◦C aufgeheizt und für 60 min bei dieser Temperatur gehalten. Danach wurde die Maische auf 76◦C aufgeheizt (1◦C/min) und die Temperatur für 15min gehalten. Abkühlung auf 20◦C erfolgte mit 4◦ C/min. Isothermes 65◦C-Maischverfahren Die Einmaischtemperatur betrug 65◦C und wurde 60min gehalten, danach wurde die - 13 - Temperatur [°C] Tabelle 3.2: Auswahl einiger wichtiger, im Malz enthaltener Enzyme, die jeweiligen op- timalen Temperatur- und pH-Bedingungen, sowie das Substrat auf das sie einwirken und die Produkte, die sie erzeugen. 3 Material und Methoden Enzym β-Glucan- Solubilase Endo-1,3-β- Glucanase Endo-1,4-β- Glucanase Arabinosidase Endopeptidase Carboxypeptidase Aminopeptidase Dipeptidase α-Amylase β-Amylase Maltase Grenzdextrinase Temp. [◦C] 62 40-45 40-50 40 45-55 40-50 40-50 40-50 70-75 60-65 30-40 (45) 60-62,5 pH Substrat 4,6-4,9 Matrixgebundenes β-Glucan 4,7-5,0 Lösliches hochmo- lekulares β-Glucan 4,7-5,0 Lösliches hochmo- lekulares β-Glucan 4,6-4,7 Cellobiose, Lamina- ribiose 4,0-5,1 Proteine 5,0-5,3 Proteine, Peptide 7,0-8,0 Proteine, Peptide 8,0-8,3 Dipeptide 5,6-5,8 Hoch- und nie- dermolekulare α-Glucane 5,4-5,6 α-Glucane 4,0-4,5 Maltose 5,0-5,5 Grenzdextrine Produkt Lösliches hoch- [49] molekulares beta- Glucan Niedermolekulares [49] β-Glucan, Cellobio- se, Laminaribiose Niedermolekulares [49] β-Glucan, Cellobio- se, Laminaribiose Glucose [49] Peptide, freie Ami- [50] nosäuren Freie Aminosäuren [50] Freie Aminosäuren [50] Freie Aminosäuren [50] Oligosaccharide [51] Maltose [51] Glucose Dextrine [54] [52, 53] - 14 - Amylolyse Proteolyse Cytolyse Maische mit 4◦ C/min auf 20◦C abgekühlt, das Verfahren erfolgte gemäß der MEBAK- Methode (Brautechnische Analysemethoden Band Rohstoffe) 3.1.4.11. Hochkurz-Maischverfahren Die Einmaischtemperatur betrug 62◦C und wurde 45min gehalten, dann erfolgte mit 1◦C/min eine Aufheizung auf 72◦C. Diese Temperatur wurde für 10 min gehalten, dann mit 4◦C/min auf 20◦C abgekühlt. Hochzucker-Maischverfahren Die Einmaischtemperatur betrug 62◦C und wurde 10min gehalten, dann erfolgte mit 1◦C/min eine Aufheizung auf 72◦C. Diese Temperatur wurde für 45 min gehalten, dann mit 4◦ C/min auf 20◦C abgekühlt. 35◦ C-Maischverfahren Die Einmaischtemperatur betrug 35◦C und wurde 30min gehalten, dann erfolgte mit 1◦C/min eine Aufheizung auf 72◦C. Diese Temperatur wurde für 10 min gehalten, dann mit 4◦C/min auf 20◦C abgekühlt. 45◦ C-Maischverfahren Die Einmaischtemperatur betrug 45◦C und wurde 30min gehalten, dann erfolgte mit 1◦C/min eine Aufheizung auf 72◦C. Diese Temperatur wurde für 10 min gehalten, dann mit 4◦C/min auf 20◦C abgekühlt. Eyben-Maischverfahren Die Einmaischtemperatur betrug 45◦C und wurde 30min gehalten. Er erfolgte eine Aufheizung mit einer Rate von 1◦C/min auf 62◦C, diese Rasttemperatur wurde 30min gehalten. Eine weitere Aufheizung auf 70◦C erfolgte, diese letze Rasttemperatur wur- de ebenfalls 30min lang gehalten. Zuletzt wurde die Würze mit 4◦C/min auf 20◦C abgekühlt. Die Temperaturführung des Eyben-Maischverfahren folgt dem Vorgehen in Dickel [49]. 3.4 Analytik Neben der zentralen experimentellen Durchführung von Fermentationsversuchen mit Trübungsmessungen wurden verschiedene Würzeparameter (pH-Wert, FAN, löslicher - 15 - 3 Material und Methoden Stickstoff, β-Glucan, Arabinoxylan, vergärbare Zucker) ermittelt. Bestimmung der optischen Dichte Die Trübung der fermentierenden Würze wurde zu Beginn, und jeweils 12h, 24h, 36h, 48h, 60h und 72h nach dem Zeitpunkt des Anstellens mit einem GENESYS 10S UV/VIS Spektralphotometer (ThermoFischer, Kandel) bei einer Wellenlänge von 600nm gemessen. Dazu wurden mit einer Pipette 1000μl aus dem obersten Teil der Würze in ein verschließbares Probenröhrchen übertragen und geschüttelt, um die CO2 auszutreiben. Anschließend wurden 250μl der Würze in eine Kuvette übertragen und mit 750μl deionisiertem Wasser auf eine Verdünnung von 1:4 gebracht und vor der Messung wieder durch Ausschütteln homogenisiert. Es wurden drei aufeinanderfolgen- de Messungen festgehalten und der gemittelte Wert zur Auswertung verwendet. Der initiale Wert für die optische Dichte wurde für jeden Fermentationsversuch aus dem gemeinsamen Ansatz ermittelt. Messung des pH-Werts Zur Messung des pH-Werts wurden die unvergorenen Würzen über einen Faltenfilter filtriert und mit einer SenTix pH-Messeletrode (WTW, Weilheim i. OB) gemessen. Die Kalibrierung der Messelektrode erfolgte wöchentlich mit Kalibrationslösungen bei pH 4,01 und pH 7 (WTW, Weilheim i. OB). Analyse von FAN, löslichem Stickstoff und β-Glucan Die Analyse von freiem Aminostickstoff (FAN), löslichem Stickstoff und β-Glucan er- folgte durch Mitarbeiter des Prüflabors des Lehrstuhls für Brau- und Getränketech- nologie mit den folgenden Standard-Methoden (MEBAK, Brautechnische Analysen- methoden, Band Rohstoffe, 2016): FAN: R-205.14.111 (Ninhydrin-Methode), löslicher Stickstoff: R-205.11.042 (Verbrennungsmethode nach Dumas), β-Glucan: R-205.15.170 (Fluorimetrische Methode). Bestimmung der Arabinoxylan-Gehalte Die Analyse von Arabinoxylan erfolgte mit gefilterter Würze, die sechs Tage mit Sac- charomyces diastaticus vergoren wurde, um störenden Einfluss von Hexosen zu elimi- nieren. Die Analysemethode basiert auf der Bildung und spektrometrischen Erfassung einer farbaktiven Substanz (Phloroglukid), die aus der Reaktion von Pentosen (bzw. - 16 - 3 Material und Methoden dem Zwischenprodukt Furfural) mit Phloroglukinol entsteht [55]. Für die Versuchsdurchführung wurden je 1ml achtfach verdünnter Probe mit 5ml Reaktionsreagenz versetzt. Die Reaktionsreagenz wurde dazu jeweils unmittelbar vor Versuchsdurchführung aus folgenden Komponenten hergestellt: 4,2g Phloroglucinol, wasserfrei, 98% (ThermoFischer, Kandel), 21ml Ethanol (VWR, Fontenay-sous-Bois, Frankreich), 231 ml Essigsäure, Eisessig (Fisher Scientific, Loughborough, Großbritan- nien) und 4,2ml Salzsäure, 37% (Merck, Darmstadt). Zur Verwendung kamen wegen der Lichtempfindlichkeit der Reaktion braune Reagenzgläser. Nach Zusatz der Reakti- onsreagenz wurden die Reagenzgläser mit einem Stopfen verschlossen und für 25 min in kochendes Wasser gestellt. Nach Ablauf der Kochzeit wurden die Proben in einem Bad mit Eiswasser innerhalb von vier Minuten auf Raumtemperatur abgekühlt. Zur Erfassung der Färbereaktion wurden je 250 μl Probe vierfach in eine Microtiter- platte pipettiert und in einem Synergy H4 Microtiterplatten-Leser (BioTek, Winooski, VT, USA) in zeitlichen Abständen von 15 min, 20 min, 22,5 min und 25 min gerechnet ab Beginn der Probenabkühlung gemessen. Zur Auswertung der Messungen wurde die Reaktion zusätzlich an einer Verdünnungs- reihe von Xylose (0, 50, 100, 150, 200, 250 und 300mg/l) durchgeführt. Diese Ver- dünnungsreihe diente als Kalibrationskurve für die Messwerte. Eine Überprüfung der Reaktion erfolgte mit zwei Arabinoxylan-Standards (200 und 500 mg/l). Die Standard- Lösungen und die Verdünnungsreihe von Xylose wurden ebenfalls in die jeweiligen Mi- crotiterplatten pipettiert und zeitgleich mit den Proben gemessen. Die Auslesung der Absorptionen der Proben wurde bei den Wellenlängen 550 nm und 505nm durchgeführt. Zur Berechnung von Arabinoxlan-Gehalten wurde bei der Aus- wertung die Absorption bei 505nm von der bei 550nm abgezogen, um den störenden Einfluss von Sechsfachzuckern zu eliminieren [56]. Die Werte der gesuchten Arabinox- langehalte konnten dann durch Interpolation einer Gleichung zweiter Ordnung aus der Standard-Xylose-Kurve errechnet werden [55]. Bestimmung der Gehalte vergärbarer Zucker Die analytischen Bestimmung der Gehalte an vergärbaren Zuckern erfolgte mittels Hochdruck-Ionenchromatographie (HPIC). Zur Probenvorbereitung wurden je 1 ml der unvergorenen Würzeproben durch einen Spritzenvorsatzfilter (0,45μm) gedrückt. An- schließend wurden 1ml Messlösung aus mit bidestilliertem Wasser verdünnter Probe - 17 - 3 Material und Methoden Probe 50 Bidest. Wasser 900 900 900 Verdünnungsfaktor 1:20 1:20 1:20 50 50 3 Material und Methoden und internem Standard in ein 1 ml Schraubvial pipettiert und mit geschlitzten Septen verschlossen. Als interner Standard wurde eine Lösung aus 1g/l 2-Deoxy-D-Glucose (Sigma-Aldrich, München) hergestellt. Die Verdünnung mit Wasser wurde aus den, je nach Maischverfahren unterschiedlich hohen, erwarteten Zuckergehalten abgeschätzt. Die Zusammensetzungen der Messlösungen und die Verdünnungsfaktoren der Proben der verschiedenen Maischverfahren sind in Tabelle 3.3 angegeben. Tabelle 3.3: Zusammensetzung der Messlösung für die Bestimmung der vergärbaren Zu- cker mittels Hochdruck-Ionenchromatographie, alle Zahlenangaben in [μl] Maischverfahren I65 HK-M HK Int. Standard 50 50 50 HZ E35 50 50 100 200 850 750 1:10 1:5 E45 Eyben LuS 50 50 50 100 50 50 850 900 900 1:10 1:20 1:20 Die Messung der Zuckergehalte erfolgte in einem Dionex Kandel), die Spezifikation der verwendeten Trennsäulen war CarboPack PA10 Guard, 2*500mm und Trennsäule: Dionex CarboPack PA10 Analy- tical, 2*250mm (ThermoFischer, Kandel). Zur Kalibrierung wurde eine Lösung aus je 60 mg/100 ml D(+)Glucose, D(-)Fructose, Saccharose und je 600 mg/100 ml Maltose und Maltotriose verwendet (alle: Sigma-Aldrich, München) verwendet. Die Datenauf- nahme und -auswertung erfolgte mit der Laborsoftware Chromeleon 6.0 (ThermoFi- scher, Kandel). - 18 - ICS 5000 (ThermoFischer, wie folgt: Vorsäule: Dionex 4 Eigene Arbeiten 4.1 Definition von standardisierten Bedingungen Die Tendenz der Hefe zur Flockenbildung hängt von vielerlei Faktoren ab [7, 8, 12, 15, 18, 22, 23, 24, 26, 28, 31, 57], wie bereits in Kapitel 2 ausführlich diskutiert wur- de. Deshalb mussten, soweit möglich, vergleichbare Vorraussetzungen für die Durch- führung der Versuche geschaffen werden, um interferierende und im Nachhinein nicht evaluierbare Umwelteinflüsse auf die Flokkulation auszuschalten. Im Rahmen dieser Ar- beit wurden daher die Hefepropagation, die Würzebereitung und die Durchführungen der Fermentationstests unter standardisierten Bedingungen durchgeführt, wie in Kapi- tel 3 beschrieben. Parameter wie Propagationszeiten, Zusammensetzung und Volumina von Nährmedien sowie die Bedingungen bei der Durchführung der Fermentationstests (Temperatur, Volumen der Anstellwürze, Beprobungsintervalle) ließen sich leicht und reproduzierbar kontrollieren. Ein Faktor nicht genau quantifizierbarer Unsicherheit ist die Bestimmung der Zell- zahl unmittelbar vor dem Anstellen der Testwürzen. Da, der Prozedur von Lake et al. [46] folgend, das Waschen der Anstellhefe in destilliertem Wasser stattfand, war eine zügige Bestimmung der Zellzahl kritisch, weil sonst ein rapider Abfall der Viabilität und Vitalität der Hefe zu befürchten war, die in deionisiertem Wasser erheblichem os- motischem Stress ausgesetzt ist. Aus diesem Grund wurde auf die Bestimmung des Lebend-/Totanteils mit Methylenblaufärbung verzichtet. Nach zwei ausgezählten Groß- quadraten der Thomakammer (32 Kleinquadrate) erfolgte Mittelwertbestimmung der Hefezellzahl. Der Fehler in der Bestimmung der Zellzahl wird pauschal mit 20% ab- geschätzt. Dies spiegelt die Variation in der Trübung der Würzen zum Zeitpunkt des Anstellens wider, siehe Tabelle 4.1. Bei der Entnahme von Proben aus den Fermentations-Reagenzgläsern zur Messung der Trübung kam es im Zeitraum von 12 bis 48h nach Anstellen der Proben zu mehr oder weniger starkem Aufschäumen aller fermentierenden Würzen. Hierbei sind zwei Gesichtspunkte problematisch und zu diskutieren. Zum einen erfolgte durch die teils bis einen Zentimeter unter den Flüssigkeitsspiegel gehende Bildung von CO2-Bläschen eine Verwirbelung der Flüssigkeit im obersten Teil des Reagenzglases. So könnten bei einzelnen Messungen auch Flüssigkeitsanteile höherer Trübung aus tieferen Schichten des Reagenzglases zur Beprobung gekommen sein. Zum anderen konnte nicht immer - 19 - 4 Eigene Arbeiten 4 Eigene Arbeiten sichergestellt werden, dass die aus dem Reagenzglas entnommene Flüssigkeitsmenge genau 1 ml betrug, vor allem wenn es in der Pipettenspitze selbst zur Schaumentwick- lung gekommen, und so ein kleiner Teil der Würze im Reagenzglas verblieben war. Tabelle 4.1: Trübung der Würzen unmittelbar nach dem Anstellen mit Hefe zum Zeit- punkt t=0 h, alle Zahlenangaben in gemessener photospektrometrischer Absorption bei 600 nm (dimensionslos), N=3 Maischverfahren PYF-negativ PYF-positiv Maischverfahren PYF-negativ PYF-positiv I65 0,90 ± 0,05 0,88 ± 0,01 E35 0,96 ± 0,14 1,00 ± 0,18 HK-M 0,66 ± 0,02 0,71 ± 0,07 E45 0,93 ± 0,10 0,91 ± 0,08 HK 0,81 ± 0,09 0,90 ± 0,01 Eyben 0,84 ± 0,10 0,69 ± 0,10 HZ 0,71 ± 0,03 0,65 ± 0,01 LuS 0,79 ± 0,01 0,75 ± 0,01 4.2 Verlauf der Fermentationstests Den zentralen Teil des experimentellen Programms dieser Arbeit stellt die Durchführung von miniaturisierten Fermentationstests nach Lake et al. [46] dar. Der zeitliche Verlauf aller durchgeführten Fermentationstests, die jeweils mit Würzen aus PYF-negativem und PYF-positivem Malz durchgeführt wurden, ist in Abbildung 4.1 zusammenfassend dargestellt. Die Messdaten zu den Versuchen sind in Tabelle 7.1 im Anhang aufgeführt. Bereits dem visuellen Anschein nach kann in den durchgeführten Fermentationstests eine eindeutige Unterscheidung der beiden untersuchten Malztypen erfolgen. Die Trü- bungswerte für Würzen aus PYF-positivem Malz erscheinen dabei gegen Ende der Fer- mentationstests (Messzeitpunkte t=48 h und t=72 h) deutlich niedriger als die für PYF- negative Malze. Die Messungen im Bereich zwischen t= 12 h bis t=36 h lassen dagegen wegen der größeren Streuung der Messwerte weniger gut zwischen den beiden Malzty- pen unterscheiden. Es sollen im Folgenden aber verschiedene Möglichkeiten und An- sätze zur Einordnung der verschiedenen Maischverfahren erarbeitet werden, mit denen ihr Einfluss auf das Flokkulationsverhalten der Hefe sowohl qualitativ wie quantitativ abgeschätzt werden kann. - 20 - AE 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 BF 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 CG 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 DH 2.5 4 Eigene Arbeiten 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 0 20 40 60 Zeit [h] Abbildung 4.1: Ergebnisse der Fermentationstests nach Lake et al. [46]. Die Box- plots für PYF-negative Malze sind blau, die für PYF-positive Malze rot gefärbt. Zur besseren Unterscheidung sind die Boxplots von PYF-positiven Malzen zusätz- lich etwas nach rechts verschoben. A: Isothermes 65◦C-Maischverfahren, B: Hochkurz- Maischverfahren (Hefe in Malzextrakt propagiert), C: Hochkurz-Maischverfahren, D: Hochzucker-Maischverfahren, E: 35◦C-Maischverfahren, F: 45◦C-Maischverfahren, G: Eyben-Maischverfahren, H: Maischverfahren nach Lake et al. [46] - 21 - Trübung bei 600 nm 4.2.1 Qualitative Diskriminierung von PYF-positivem Malz Wie bereits frühere Untersuchungen mit miniaturisierten Fermentationstests gezeigt haben [46, 48] konnte eine erfolgreiche Unterscheidung von PYF-negativem und PYF- positivem Malz bereits nach einer Versuchsdauer von 48 h erfolgen. Zur Beantwortung der Frage, ob eine statistisch gesicherte Unterscheidung der Trü- bungsmessungen von PYF-negativem und PYF-positivem Malz für die durchgeführten Fermentationsversuche gemacht werden kann, wurden Mittelwertvergleiche mit einem t-Test für alle Probennahmezeitpunkte durchgeführt. Dabei wurde auf niedrigere op- tische Dichte bei PYF-positiven Malzen getestet. Die dadurch ermittelten Werte für das Konfidenzniveau der t-Tests sind in Tabelle 4.2 für die Messzeitpunkte t=48 h und t=72 h aufgeführt. In Abbildung 7.1 im Anhang sind die Ergebnisse der t-Tests zu allen Messzeitpunkten graphisch aufgetragen. Ebenso wie in früheren Arbeiten [46, 48] konnte zum Messzeitpunkt t=48 h bei allen Fermentationsversuchen, mit Ausnahme des Hochkurz-Maischverfahrens, eine Unter- scheidung von PYF-negativem und PYF-positivem Malz auf einem Signifikanzniveau von über 95 % durchgeführt werden, siehe Tabelle 4.2. Bei der Hochkurz-Würze, wur- de das 95% Konfidenzniveau mit einem p-Wert von 0,063 (⇒ Konfidenzniveau von 93,7%) nur knapp verfehlt. Bei t=72h liegt das Signifikanzniveau des Mittelwertver- gleichs aber auch für das Hochkurz-Maischverfahren bei über 95% und lässt damit eine Unterscheidung zwischen den Malzsorten erkennen. Beim Vergleichstest, der mit Hochkurz-Würze durchgeführt wurde, und bei dem die Anstellhefe in Malzextrakt propagiert wurde, lag dagegen der Wert der Würzetrübung von PYF-negativem Malz sowohl bei t=48h als auch bei t=72h niedriger als der von PYF-positivem Malz. Siehe hierzu die gesonderte Diskussion in Kapitel 4.2.5. Tabelle 4.2: Mittelwertvergleich (t-Test) der optischen Dichte von PYF-negativem und PYF-positivem Malz bei t=48h und t=72h, alle Zahlenangaben für die Konfidenzni- veaus in [%], N=9 Maischverfahren Konfidenzniveau t=48 h Konfidenzniveau t=72 h I65 >99,9 >99,9 HK-M HK N/A 93,7 N/A 99,2 HZ E35 >99,9 98,3 >99,9 85,8 E45 >99,9 >99,9 Eyben 97,6 >99,9 LuS >99,9 >99,9 4 Eigene Arbeiten - 22 - Nur beim 35◦C-Maischverfahren fällt zum Messzeitpunkt t=72 h der Mittelwertver- gleich mit t-Test auf einem niedrigeren Signifikanzniveau als bei t=48h aus und liegt hier nur bei 85,8%. Der Verlauf des Fermentationstests mit der Würze aus dem 35◦C- Maischverfahren ist allerdings kritisch zu diskutieren (vorgreifend hierzu der Verweis auf die Diskussion in den Kapiteln 4.2.3 und 4.2.4). Es kam bei diesem Versuch zum geringsten Anstieg der Würzetrübung bei der Fermentation der PYF-negativen Würze. Die Werte für die Würzetrübung zeigten gar keinen Anstieg und fielen ab Versuchs- beginn stetig ab. Insofern ist es fraglich, ob es in diesem Versuch überhaupt zu einem nennenswerten Aufbau von Biomasse kam, bzw. ob hier von einem regulären Verlauf der Fermentation gesprochen werden kann. Abbildung 7.1 im Anhang zeigt, dass für das Hochzucker-, das 45◦C- und mit der oben diskutierten Einschränkung für das 35◦C-Maischverfahren ab einem Zeitpunkt von t=30 h, für das Isotherme 65◦C-Maischverfahren bereits ab einem Zeitpunkt von t=24 h signifikant niedrigere Trübungswerte (auf einem Konfidenzniveau von 95%) zu beobach- ten waren. Beim Hochkurz-Maischverfahren (siehe oben) beim Eyben-Maischverfahren und beim Maischverfahren nach Lake et al. [46] konnte diese Unterscheidung zwischen PYF-negativem und PYF-positivem Malz statistisch signifikant jdoch erst ab t=48h erfolgen. Die größere Streuung der Messwerte in der Hauptphase der Gärung zwischen 12 und 36h wurde vermutlich zum einen durch eine generell höhere Scherrate in der Würze durch aufsteigende CO2-Bläschen verursacht, zum anderen durch Aufschäumen bei der Probennahme noch zusätzlich vergrößert und erschwerte in diesem zeitlichen Bereich eine Unterscheidung der beiden Malzsorten mit einem Mittelswertvergleich. Damit lässt sich zusammenfassen, dass der Fermentationstest nach der Methode von Lake et al. [46] robust genug ist, um bei allen in dieser Untersuchung angewandten Maischverfahren und dem hier eingesetzten Hefestamm und der verwendeten Malzsor- te einen signifikanten Unterschied zwischen PYF-negativem und PYF-positivem Ver- gleichsmalz erkennen zu lassen. 4.2.2 Ansatz I zur Quantifizierung: numerische Integration der Trübungswerte Der Nachweis, dass die gewählte Versuchsmethodik als Test für einen qualitativen Nach- weis von PYF-positivem Malz auch unter veränderter Würzezusammensetzung geeignet ist, dient als Grundlage zur Bearbeitung weitergehender Problemstellungen. Von beson- - 23 - 4 Eigene Arbeiten 4 Eigene Arbeiten derem Interesse ist dabei die Frage, inwiefern sich eine veränderte Würzezusammenset- zung auf quantifizierbare Unterschiede im Hervortreten des PYF-Effekts auswirkte. Der in diesem Abschnitt verfolgte Ansatz zu einer quantitativen Einordnung der Maischverfahren besteht in der Berechnung der Flächen, die während eines Fermentati- onsversuchs von den Trübungsmessungen jeweils für PYF-negatives und PYF-positives Malz aufgespannt werden und anschließender Bildung des Quotienten dieser beiden Flä- chen. Die Berechnung der Flächen erfolgt segmentweise mit den Mittelwerten der Trü- bungsmessungen und der Flächenformel für Trapeze (A = (Messzeitn − Messzeitn−1) ∗ (Trübungn + Trübungn−1)/2) und schließlich Summenbildung über die Versuchsdau- er. Die ermittelten Quotienten der ermittelten Flächen unter den Messpunkten für die Würzetrübung, gerundet auf zwei Dezimalstellen, sind als Zahlenwerte in Tabelle 4.3 angegeben. Tabelle 4.3: Werte für die Quotienten der Flächen die durch die Messpunkte der Wür- zetrübung aufgespannt werden. Maischverfahren I65 HK-M HK HZ E35 E45 Eyben LuS Quotient 1,29 1,01 1,30 1,37 1,09 1,27 1,48 1,05 Aufgrund des hier angewandten Vorgehens können die Maischverfahren damit hin- sichtlich ihres Vermögens zwischen den beiden Malzsorten das Phänomen PYF zu ver- stärken in eine Reihenfolge gebracht werden: Die höchsten Werte wurden für das Eyben-Maischverfahren mit 1,48 und das Hochzucker- Verfahren mit 1,37 ermittelt. Beim 45◦C-, beim Isothermen 65◦C-, und beim Hochkurz- Maischverfahren lagen die Werte in einem relativ engen Bereich von 1,27 bis 1,30. Die niedrigsten Werte für die Quotienten aus den Flächen von PYF-negativem zu PYF-positivem Malz ergaben sich für das 35◦C-Maischverfahren mit 1,09 und das Maischverfahren nach Lake et al. [46] mit 1,05. Im Vergleichstest mit dem Hochkurz- Maischverfahren, bei dem die Anstellhefe in Würzeextrakt propagiert wurde, wurde der niedrigste Wert von 1,01 ermittelt, siehe hierzu die Diskussion in Kapitel 4.2.5. Dieses Ergebnis kann auch rein anschaulich in Abbildung 4.2 nachvollzogen werden. Die dort gezeigten Kurvenverläufe stammen aus lokal gewichteter linearer Regression der Messwerte der Würzetrübung [58]. In der Abbildung stellen die grauen Bänder um die Kurvenverläufe jeweils den Bereich des 95%-Konfidenzintervalls dar. Treten hier - 24 - weiße Zwischenräume zwischen den Kurven auf, kann dies als signifikante Abweichung im Verlauf der Fermentationen von PYF-negativer und PYF-positiver Würze interpre- tiert werden. ?? FAZIT ?? ZUSAMMENFASSUNG ?? 4.2.3 Ansatz II zur Quantifizierung: Zeitpunkt maximaler Würzetrübung Eine charakteristische Eigenschaft des Phänomens premature yeast flocculation ist ins- besondere das frühere Ausflocken der Hefe im Vergleich zum regulären Verlauf einer Fermentation mit PYF-negativem Malz [31]. Modellhaft kann der Verlauf der in dieser Untersuchung furchgeführten Fermentationstests in zwei Phasen eingeteilt werden. In der ersten Phase nimmt die Würzetrübung durch Vermehrung der Hefe zu, hier über- wiegt der Zuwachs an Biomasse die Sedimentationsrate im Reagenzglas. In der zweiten Phase kommt es dann ab einem gewissen Zeitpunkt, bei abnehmender Wachstumsrate der Hefe, zu einer überwiegenden Klärung der Würze, da jetzt mehr Hefezellen durch Sedimentation und Flockenbildung aus dem Medium ausfallen als neu gebildet werden [59]. Der Zeitpunkt zu dem die maximale Trübung erreicht ist, wird hier definiert als der Übergang zwischen diesen beiden Phasen. Es sollte untersucht werden, ob die durchgeführten Maischverfahren einen Einfluss auf die zeitliche Differenz bewirken, in der die maximale Trübung bei PYF-negativem und PYF-positivem Malz erreicht wird. Zur Berechnung des Zeitpunkts maximaler Trübung wurden geglättete Regressions- kurven nach der LOWESS-Methode (locally weighed smoothing scatterplot, Hintergrün- de in Cleveland [58] mit der Statistic Software R in Verbindung mit dem Grafik-Paket ggplot erzeugt [60, 61]. Abbildung 4.2 zeigt die berechneten geglätteten Kurven der Fermentationsverläufe mit Markierung der Zeitpunkte maximaler Würzetrübung für PYF-negatives (durchgezogene Linien) und PYF-positives Malz (gestrichelte Linien). Der Zeitpunkt maximaler Trübung für die durchgeführten Fermentationsversuche ist in Tabelle 4.4 angegeben. Die rechnerisch erhaltenen Werte wurden auf ganze Stunden gerundet, um eine Vorspiegelung höherer Genauigkeit zu vermeiden. In Tabelle 4.4 ist in der mit ∆ bezeichneten Spalte der zeitliche Unterschied zwischen den Maxima der Fermentation von PYF-negativem und PYF-positivem Malz gegeben. Dabei zeigen ne- gative Werte an, dass die maximale Trübung von PYF-positivem Malz früher erreicht wurde. - 25 - 4 Eigene Arbeiten AE 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 BF 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 CG 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 DH 2.5 4 Eigene Arbeiten 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 0 20 40 60 0 20 40 60 Zeit [h] Abbildung 4.2: LOWESS-Regression der Fermentationsversuche, eine durchgezogene Linie kennzeichnet die maximale Trübung für PYF-negative Malze, eine gestri- chelte Linie die maximale Trübung für PYF-positive Malze. A: Isothermes 65◦C- Maischverfahren, B: Hochkurz-Maischverfahren (Hefe in Malzextrakt propagiert), C: Hochkurz-Maischverfahren, D: Hochzucker-Maischverfahren, E: 35◦C-Maischverfahren, F: 45◦C-Maischverfahren, G: Eyben-Maischverfahren, H: Maischverfahren nach Lake et al. [46]. - 26 - Trübung bei 600 nm Tabelle 4.4: Zeitpunkt der maximalen Trübung der Würzen, Angabe in h seit Anstellen der Würze. ∆ ist die zeitliche Differenz in h zwischen Maximum in PYF-negativer und PYF-positiver Würze, negative Werte zeigen an, dass Fermentation von PYFpositivem Malz maximale Trübung früher erreichte. Maischverfahren I65 HK-M HK HZ E35 E45 Eyben LuS PYF-negativ PYF-positiv ∆ 14 23 25 17 10 17 24 16 13 22 24 15 1 10 16 18 -1 -1 -1 -2 -9 -7 -8 +2 4 Eigene Arbeiten Die größten Differenzen im Erreichen der maximalen Trübung konnten beim 45◦C- Maischverfahren mit sieben Stunden und beim Eyben-Maischverfahren mit acht Stun- den beobachtet werden. Der für das 35◦C-Maischverfahren ermittelte Wert von neun Stunden früherem Ma- ximum in der Würzetrübung von PYF-positivem Malz ist sehr kritisch zu betrachten. Es fand bei diesem Versuch (wie gut in Abbildung ?? zu erkennen ist) kaum nennens- werte Zunahme der Trübung bei PYF-negativem Malz und beim PYF-positiven Malzes praktisch gar keine Zunahme in der Würzetrübung statt, hier fielen die Messwerte ab dem Zeitpunkt des Anstellens stetig ab. Insofern ist fraglich, ob hier eine richtiggehende Fermentation mit Zuwachs an Biomasse überhaupt stattfand. Das Ergebnis einer um neun Stunden früheren Würzetrübung im PYF-positivem Malz kann demnach als nur eingeschränkt aussagekräftig betrachtet werden. Für das Isotherme 65◦C-, das Hochkurz- und das Hochzucker-Maischverfahren wur- de die maximale Würzetrübung bei der Fermentation von PYF-positivem Malz um ein bis zwei Stunden früher erreicht als bei PYF-negativem Malz. Beim Lake und Speers-Maischverfahren schließlich erreichte rein rechnerisch das PYF-negative Malz die maximale Trübung um zwei Stunden früher als das PYF-positive. Da die für diese Maischverfahren rein rechnerisch ermittelten Zeitdifferenzen im Erreichen der maxima- len Trübung der Würzen im 95% Konfidenzband der LOWESS-Regression zu liegen kamen, kann hier kein signifikanter Unterschied postuliert werden. - 27 - 4.2.4 Ansatz III: Vergleich der Flokkulationsphase in den Malztypen In einem weiteren Ansatz zur Charakterisierung von Unterschieden im Fermentations- verlauf von PYF-negativen und PYF-positiven Würzen sollte die Sedimentations- bzw. Flokkulationsphase der Fermentation untersucht werden, siehe hierzu die Erläuterungen in Kapitel 4.2.3. Zu diesem Zweck wurden die Steigungen, mit der die Trübung der Würze nach Er- reichen ihres Maximums bis zum Messzeitpunkt t=48 h hin abfielen, jeweils für PYF- negatives und PYF-positives Malz berechnet und durch Division in Verhältnis zuein- ander gesetzt. Die Werte für Abfall in beiden Malztypen und ihres daraus berechneten Verhältnisses sind in Tabelle 4.5 für alle durchgeführten Maischverfahren angegeben. Tabelle 4.5: Abfall der Trübung in der Flokkulationsphase der Fermentation. 4 Eigene Arbeiten Maischverfahren mP Y F −negativ mP Y F −positiv Verhältnis neg/pos I65 HK-M HK -0,028 -0,047 -0,008 -0,028 -0,019 -0,026 1,00 2,47 0,31 HZ E35 E45 -0,020 -0,008 -0,020 -0,022 -0,009 -0,012 0,91 0,89 1,67 Eyben LuS -0,013 -0,025 -0,013 -0,025 1,92 0,52 Bei der Interpretation dieser Werte muss auf folgende Punkte hingewiesen werden: Bei (modellhafter) Fermentation einer Würze aus PYF-positivem Malz sollte der Ma- ximalwert der Trübung niedriger sein als der bei Fermentation einer Würze aus PYF- negativem Malz. Damit ergibt sich ein tendenziell größerer Abfall der Trübung für PYF-negative Malze. Verstärkt wird dieser Effekt durch früheres Erreichen der maxi- malen Würzetrübung in PYF-positivem Malz. Je höher der rechnerisch ermittelte Wert aus dem Verhältnis der beiden Steigungen der Würzetrübung in der Flokkulationsphase einer Fermentation also über eins zu liegen kommt, desto besser lässt sich theoretisch zwischen PYF-positivem und PYF-negativem Malz unterscheiden. Nicht für alle Maischverfahren können die ermittelten Werte sinnvoll interpretiert werden. Bei den Fermentationstest von Hochkurz-, 35◦C- und Maischverfahren nach Lake et al. [46] ist eine Vorraussetzung nicht erfüllt, nämlich, dass im PYF-positiven Malz eine niedrigere Würzetrübung als im PYF-negativen auftritt, daher ergeben sich z.B. die niedrigen Werte von 0,31 für das Hochkurz-Verfahren und 0,52 beim Maische- verfahren nach Lake et al.. Die Bewertung des 35◦C-Maischverfahrens wurde in Kapitel - 28 - 4.2.3 kritisch diskutiert. Ebenso stellt das Hochkurz-Maischverfahren, bei dem Hefe- propagation in Malzextrakt durchgeführt wurde einen Sonderfall dar, siehe hierzu die Diskussion in Kapitel 4.2.5. Eine gute Unterscheidung zwischen PYF-negativem und PYF-positivem Malz ist mit dem hier vorgestellten rechnerischen Ansatz beim 45◦C- und beim Eyben-Maischverfahren möglich Da beim Isothermen 65◦C- und beim Hochzucker-Maischverfahren kein Zeitun- terschied im Erreichen der maximalen Würzetrübung festgestellt werden konnte, liegen hier die Verhältnisse in den Steigungen für den Trübungsabfall bei 1,00 bzw. 0,91. 4.2.5 Vergleichstest mit in Malzextrakt propagierter Hefe Die Hefe für die Fermentationsversuche wurde in Befolgung der Versuchsbeschreibung von Lake et al. [46] für alle Maischverfahren in YEPD-Medium propagiert. Zusätzlich wurde für das Hochkurz-Maischverfahren ein zweiter Versuch mit in Malzextrakt propa- gierter Hefe durchgeführt, siehe Kapitel 3.1. Als potentiellen Ansatz für Folgearbeiten sollten mögliche Auswirkungen auf den Versuchsverlauf evaluiert werden, die sich z.B. aus besserer Adaption der Hefe an das Fermentationsmedium Würze und damit an Maltose ergeben könnten [62]. Eine bemerkenswerte Feststellung in der Auswertung dieses Versuchs ist, dass dies der einzige Fermentationsversuch war, bei dem zum Zeitpunkt t=48h nach Anstellen der Würze keine korrekte Unterscheidung zwischen PYF-negativem und PYF-positivem Malz möglich war, siehe Kapitel 4.2.1. Der durchgeführte t-Test weist im Gegenteil niedrigere Trübungswerte für das PYF-negative Malz aus (bei einem Konfidenzniveau >95 %). Der mit der Trapezmethode ermittelte Quotient der Flächen, die von den Mess- punkten der Trübungsmessungen aufgespannt werden, hat mit 1,01 den niedrigsten er- mittelten Wert aller Fermentationsversuche. Als weitere Besonderheit kann angeführt werden, dass die Würzetrübung für das PYF-negative Malz den höchsten gemessenen Wert erreicht, und zwar ausgehend vom niedrigsten Wert für die optische Dichte zum Anstellzeitpunkt. Auch in den Begleitanalysen, die an den hergestellten Würzen durchgeführt wurden, lassen sich beim Vergleichsversuch der Hochkurz-Maische mit in Malzextrakt propa- gierter Hefe Anomalitäten erkennen. Augenfällig ist ein im Vergleich zu allen anderen Würzen deutlich abweichender niedrigerer pH-Wert, siehe Kapitel 4.4 und Abbildung 4.4. Auch in den ermittelten Gehalten für β-Glucan zeigt der betrachtete Fermenta- - 29 - 4 Eigene Arbeiten tionsversuch eine Anomalie. In Abweichung des für die anderen Würzen beobachteten Musters wurde allein bei diesem Maischverfahren ein höherer Gehalt an β-Glucan für das PYF-negative Malz gemessen, siehe Kapitel 4.7 Abbildung 4.7. Da die Versuchsdurchführung, wie in Kapitel 4.1 beschrieben, unter standardisierten Bedingungen stattfand, muss sich eine Interpretation der beobachteten Abweichungen auf das Unterscheidungsmerkmal der unterschiedlichen Hefepropagation stützen. Der starke Anstieg in der Würzetrübung beim PYF-negativen Malz lässt sich even- tuell mit einer guten Adaption der Hefe an Maltose durch Propagation in Malzextrakt erklären und dem damit verbundenen starken Zuwachs an Biomasse [62]. Tatsächlich liegen die ermittelten Werte für die Maltosegehalte der Hochkurz-Maischverfahren im Vergleich aller Maischverfahren am höchsten, vergleiche Kapitel 4.3 und Abbildung 4.3. Möglicherweise kam es dann zu einer relativ schnellen Umsetzung der in der Würze verfügbaren Nährstoffe, damit verbunden zu einem schnellen Abfallen der Scherrate im Medium durch CO2-Bläschen und somit zu dem beobachteten rapiden Abfall in der Würzetrübung in der PYF-negativen Würze. Die Abweichungen in den Analysewerten von pH-Wert und β-Glucan sind nicht ein- fach erklärbar, da die Bereitung beider Hochkurz-Würzen unter identischer Temperatur- führung (mit demselben Maischprogramm) stattfand und somit eigentlich im Rahmen der Reproduzierbarkeit identische Werte in den Begleitanalysen zu erwarten waren. 4.3 Einfachzucker und vergärbare Zucker Die gemessenen Werte für die Zuckergehalte folgen in grundsätzlicher Übereinstimmung den Variationen der Temperaturführungen der angewandten Maischprogramme und den dadurch in ihren Aktivitäten beeinflussten amylolytischen Enzymen, siehe hierzu und zur Diskussion der Zuckergehalte Tabelle 3.2, die Messdaten der Zuckeranalysen sind im Anhang in Tabelle 7.2 aufgeführt. Einen Überblick über die Gehalte an Einfachzu- ckern (Glucose und Fructose) sowie den Gesamtgehalt aller vergärbaren Zucker bietet Abbildung 4.3. Den niedrigsten Gehalt an Einfachzuckern brachte das Isotherme 65◦C-Maischverfahren. Hier könnte die hohe Einmaischtemperatur von 65◦C eine relativ rasche Denaturie- rung der β-Amylase bewirkt haben. Tendenziell etwas höhere Werte wurden beim Hochzucker-Maischverfahren gemessen, hier macht sich vermutlich die 10minütige Tem- peraturrast bei 62◦C bemerkbar. Mit den Hochkurz- und Hochzucker-Maischverfahren - 30 - 4 Eigene Arbeiten 4 Eigene Arbeiten hergestellte Würzen weisen Gehalte an Einfachzuckern auf, die im mittleren Bereich der Werte liegen. Bemerkenswerter Weise liegen die Gehalte an Einfachzuckern für die Maischverfahren mit niedrigen Einmaischtemperaturen am höchsten (35◦C-, 45◦C- und Eyben-Maischverfahren sowie das Maischverfahren nach Lake et al.). Die niedrigen Einmaischtemperaturen und die bei Eyben- und Lake-Verfahren intensiven Maischpro- gramme begünstigten hierbei vermutlich die Aktivität der β-Amylase. Die Trennung in Gruppen fällt beim Gesamtzuckergehalt, auch wegen der größe- ren Streuung der Messwerte schwieriger. Hier kann lediglich das Hochkurz-Verfahren mit tendenziell höheren Gehalten alleingestellt werden, die anderen Verfahren brachten Zuckergehalte mit sich, die im Rahmen der Streuung der Messwerte nicht signifikant voneinander unterschieden werden können. Das Isotherme 65◦C-Verfahren liegt hier aber wieder am unteren Bereich, hier wurde das Temperaturoptimum der α-Amylase nicht erreicht. 10 8 6 4 90 80 70 I65 HK−M HK Maischverfahren und Malztyp LuS I65 HK−M HK Maischverfahren und Malztyp HZ E35 E45 Eyb HZ E35 E45 Eyb LuS Abbildung 4.3: Zuckergehalte der hergestellten Würzen. A: Gehalte an Einfachzuckern (Glucose und Fructose), B: Summe aller vergärbaren Zucker (Glucose, Fructose, Sac- charose, Maltose, Maltotriose), N=3. Eine einfache Korrelation zwischen Zuckergehalten und dem Verlauf der Fermentatio- - 31 - Einfachzucker [g/l] Vergärbare Zucker [g/l] nen von PYF-negativem und PYF-positivem Malz der verschiedenen Maischprogramme kann nicht erkannt werden. Die durch unterschiedliche Temperaturführung der Maisch- programme hervorgerufenen Unterschiede in den Gehalten der Einfachzucker werden durch Zugabe von 4 % Glucose, also immerhin etwa 40 g/l, stark nivelliert. Die in Ka- pitel 4.2.1 bis 4.2.5 diskutierten Unterschiede, die die verschiedenen Maischverfahren in der Trennung von PYF-negativem und PYF-positivem Malz bewirken lassen sich also mit den hier durchgeführten Versuchen nicht erklären. Weiterhin konnte ein Zusammenhang zwischen dem Malztyp und den Zuckergehalten nicht festgestellt werden. Es liegen zwar für das 35◦C-Maischverfahren und das Eyben- Maischverfahren im PYF-negativen Malz etwas höhere Gehalte in der Glucose vor, siehe Abbildung 7.2 im Anhang. Ansonsten liegen die Zuckergehalte aber für PYF-negative und PYF-postive Malz innerhalb der Streuung der Messwerte. Bei den Zuckergehalten überwiegt also ganz eindeutlich der Einfluss der Temperaturführung beim Maischver- fahren gegenüber dem Einfluss der durch den Malztyp hervorgerufen wird. 4.4 PH-Werte Abbildung 4.4 zeigt für die verschiedenen Maischverfahren jeweils für PYF-negatives (blau hinterlegt) und PYF-positives (rot hinterlegt) Malz getrennt die gemessenen pH- Werte. Bei der verwendeten Malzsorte lässt sich hier ein eindeutige eindeutige Korre- lation des pH-Werts zum Malztyp ablesen. Dabei wurden in Würzen, die aus PYF- negativem Malz hergestellt wurden, durchgängig höhere pH-Werte gemessen als in den korrespondierenden Würzen aus PYF-positivem Malz. Die Werte für PYF-negatives Malz liegen dabei zwischen 0,13 bis 0,27 Punkte höher als für PYF-positives Malz. Eine augenfällige Abweichung im pH-Wert trat bei einem der durchgeführten Hochkurz- Verfahren auf. Die Messungen liegen hier um ca. 0,6 Punkte niedriger als in den rest- lichen Würzen, wobei sich das Muster von niedrigerem pH-Wert für die Würze aus PYF-positivem Malz auch hier zeigt. Inwiefern diese Abweichung durch einen systema- tischen Messfehler, z.B. durch eine mangelhaft gelagerte Messelektrode hervorgerufen wurde, kann nicht nachvollzogen werden. Bei Untersuchungen zur Abhängigkeit der Hefeflokkulation konnte bereits in früheren Untersuchungen ein grundsätzlicher Zusammenhang mit dem pH-Wert des Fermenta- tionsmediums nachgewiesen werden [57]. Einige der untersuchten Hefestämme zeigten dabei eine mit abnehmendem pH-Wert stärkere Neigung zur Flokkulation. Der kriti- - 32 - 4 Eigene Arbeiten 5.75 5.50 5.25 5.00 4.75 4 Eigene Arbeiten sche Bereich, in dem ein Anstieg in der Neigung zur Flockenbildung zu beobachten war, lag etwa zwischen 6,0–5,0 [57]. In diesem kritischen Bereich liegen auch die in dieser Untersuchung ermittelten pH-Werte. Somit kann ein direkter Zusammenhang von ver- stärkter Flokkulation der PYF-positiven Malze und niedrigerem pH-Wert, zumindest für den hier verwendeten Hefestamm W34/70 vermutet werden. Damit ist der pH-Wert ein potentieller Indikatorparameter, mit dem sehr schnell und vor allem frühzeitig ein problematisches Malz identifiziert werden könnte. I65 HK−M HK HZ E35 E45 Maischverfahren und Malztyp Eyb LuS Abbildung 4.4: Variation der pH-Werte mit Malztyp und Maischverfahren. 4.5 Löslicher Stickstoff Die gemessenen Gehalte an löslichem Stickstoff sind in Abbildung 4.5 für alle Maisch- verfahren getrennt nach PYF-negativem Malz in blau und PYF-positivem Malz in rot dargestellt. Die Boxplots stellen in dieser Abbildung für N=3 die Bandbreite der er- mittelten Werte dar. Die Messwerte dazu sind in Tabelle 7.3 im Anhang aufgeführt. Die für den löslichen Stickstoff ermittelten Gehalte bewegen sich innerhalb einer ge- samten Bandbreite von 620 bis 880 mg/l und liegen damit im Rahmen der Werte, die für moderne, gut gelöste Malze in der Fachliteratur angegeben werden [63, 64]. Beim Eyben- und beim Maischverfahren nach Lake et al. wurden die höchsten Gehalte - 33 - pH−Wert 4 Eigene Arbeiten 900 800 700 600 I65 HK−M HK HZ Maischverfahren und Malztyp Eyb LuS Abbildung 4.5: Gehalte an löslichem Stickstoff in den Würzen, N=3. für löslichen Stickstoff ermittelt. Ein erhöhter Gehalt an löslichem Stickstoff wurde beim 45◦C-Maischverfahren für die Würze aus PYF-negativem Malz gemessen, die Würze aus PYF-positivem Malz erreicht bei diesem Maischverfahren jedoch nur niedrigere Werte von etwa 680 bis 700 mg/l und liegt damit im mittleren Bereich der Werte der übrigen Maischverfahren. Für das Isotherme 65◦C-, das Hochkurz-, das Hochzucker- und das 35◦C-Maischverfahren überlappen sich die Stickstoffgehalte größtenteils innerhalb der Probenstreuung. Trotz der teilweisen Überlappung in den Gehalten an löslichem Stickstoff zwischen den verschiedenen Maischverfahren lässt sich eine Tendenz zu höheren Stickstoffgehal- ten in den Würzen aus PYF-negativen Malzen erkennen. Dieser Unterschied ist im vorliegenden Datensatz für das Hochkurz-, das Hochzucker-, das 45◦-, das Eyben- und das Maischverfahren nach Lake et al. besonders deutlich ausgeprägt, wobei sich Tenden- zen zu höheren Stickstoffwerten ebenfalls beim Isothermen 65◦C-Maischverfahren und beim 35◦C-Maischverfahren ausmachen lassen, hier erlaubt aber die Streuung der Wer- te in den PYF-negativen Würzen keine definitive Aussage. Eventuell könnte hier eine Überlappung der Werte in PYF-negativem und PYF-positivem Malz durch Ausreißer verursacht worden sein. Die höheren Werte für den löslichen Stickstoff aus den Würzen, die bei Einmaischtem- - 34 - E35 E45 Löslicher Stickstoff [mg/l] peraturen von 45◦C bereitet wurden (45◦C-, Eyben- und Lake et al.-Maischverfahren) lassen sich gut in Einklang bringen mit den bei 45◦C optimal wirkenden proteolytischen Enzymgruppen, siehe Tabelle 3.2. Ein Zusammenhang zwischen mangelnder Nährstoffversorgung und verstärkter Nei- gung der Hefe zur Flockenbildung ist aus der Literatur bekannt [7, 8, 20, 22]. Insofern kann die in den Gehalten für löslichen Stickstoff beobachtete, wenn auch schwach aus- geprägte, Tendenz zu niedrigeren Werten in PYF-positivem Malz zu stärkerer Flokku- lation korreliert werden. 4.6 Freier Aminostickstoff Die für freien Aminostickstoff (FAN) gemessenen Werte sind in Abbildung 4.6 darge- stellt, die Messwerte im Anhang in Tabelle 7.3 aufgeführt. Wegen der großen Streuung der Messwerte fällt hier die Interpretation nicht leicht. 16 14 12 10 8 4 Eigene Arbeiten I65 HK−M HK HZ Maischverfahren und Malztyp Abbildung 4.6: Variation löslichem Stickstoff, N=3. 4.7 β-Glucan Ein eindeutiger Zusammenhang besteht zwischen dem Malztyp und den gemessenen Ge- halten an β-Glucan. Die β-Glucan Werte für PYF-positives Malz liegen mit Ausnahme - 35 - E35 E45 Eyb LuS FAN [mg/100ml] eines der Hochkurz-Verfahren für alle Würzen um ca. 200 mg/l höher als in Würzen aus PYF-negativem Malz. Warum es bei einem der Hochkurz-Verfahren zu einer Umkehrung dieses Verhältnisses gekommen ist, kann nicht befriedigend beantwortet werden. Eine Gruppierung der Maischverfahren nach Gehalt an β-glucan ist aufgrund der Überschneidungen in den Werten nicht möglich. Allein die frappierend höheren Wer- te im β-Glucan für die PYF-positiven Malze bieten aber möglicherweise diagnostische Ansatzpunkte zur Identifizierung von PYF mit einem Standard-Parameter der Malz- analytik. 4 Eigene Arbeiten 500 400 300 I65 HK−M HK HZ E35 E45 Eyb LuS Maischverfahren und Malztyp Abbildung 4.7: Variation von β-Glucan, N=3. 4.8 Methodik der Bestimmung von Arabinoxlan Die durchgeführten Messungen zur Bestimmung der Gehalte an Arabinoxylan mit einer kolorimetrischen Methode konnte keine signifikanten Ergebnisse erbringen. Die erhalte- nen Werte können nicht als aussagekräftig angesehen werden, da die mittels Interpolati- on aus der Kalibriergerade berechneten Werte in nicht-systematischer Weise schwanken - 36 - β−Glucan [mg/l] und sich dabei auch negative Werte ergeben (die Absorption bei 505 nm war demnach bei diesen Proben höher als die bei 550 nm). Dabei lassen sich in den Werten keine Abweichungen erkennen, die auf systematische oder zufällige Fehler in der Auswertung zurückgeführt werden könnten. Die einzige Abweichung, die sich in den Messwerten der Verdünnungsreihe von Xylose beobach- ten ließen, sind zu niedrige Werte für die Xylose-Verdünnung auf 300 mg/l. In diesen Fällen erfolgte die Kalibration der Messwerte auf Basis der Verdünnungsreihe von 0 bis 250mg/l und stellt laut frdl. mdl. Mitt. von Herrn Dr. rer. nat. Michael Kupetz ein bei dieser Methodik gelegentlich auftauchendes Phänomen, aber kein grundlegendes Hindernis für die Auswertung dar. Da auch die sonstigen Kennzahlen der Auswertung (Standardabweichungen für die Proben bei maximal 5% und ermittelte Gehalte für 200 mg/l und 500 mg/l Arabinoxylan-Lösungen innerhalb von 10 %) aber in akzeptalen Grenzen lagen, muss sich eine Diskussion der Versuche auf andere Parameter erstrecken. Die Studie nach deren Methodik die durchgeführten Untersuchungen auf Arabinoxylan- Gehalte erfolgte, diskutiert Abweichungen der Resultate, die sich auf den durchführen- den Operator zurückführen lassen [55]. Die hierbei statistisch ermittelten Abweichun- gen der Werte gleicher Proben für unterschiedliche Operatoren erklären aber nur etwa 20 % der gesamten Abweichung und können deshalb nicht als Ursache für die vorliegen- den Ergebnisse sein. Insbesondere waren die auftretenden Abweichungen systematischer Natur, die verschiedenen Operatoren konnten grundsätzlich Proben relativ zueinander korrekt einordnen. Als Ursache für nicht signifikanten Daten sollen hier zwei möglich Probleme diskutiert werden. Zum einen erscheint es möglich, dass es bei der kleinmaßstäblichen Herstellung der Würzen (200-250 ml) zu geringen Unterschieden bei einigen Prozessschritten kam (denk- bar wären hier die Kochung, Trubausfällung, Autoklavierung, Filtration). Man könnte hier nachdenken über die Definition standardisierter Bedingungen, die die entsprechen- den Parameter gleichsetzen, etwa durch Einstellen des Extrakts auf 11,1◦P vor der Kochung und Durchführung der Kochung im geschlossenen Gefäß mit Rückkühlung der Brüden. Ob jedoch die bei der Würzebereitung aufgetretenen Unterschiede groß genug sind, um die Arabinoxylan-Messungen in der beobachteten Weise zu verfälschen ist fraglich. Dennoch wäre eine noch bessere Kontrolle der Bedingungen bei der Wür- zebereitung ein Punkt, der für Folgeuntersuchungen berücksichtigt werden sollte. - 37 - 4 Eigene Arbeiten Als weitere Möglichkeit kommt die Kontamination des Hefeansatzes (Saccharomy- ces diastaticus) mit Mikroorganismen in Betracht, die Arabinoxylan verstoffwechseln können. - 38 - 4 Eigene Arbeiten 5 Schlussfolgerung und Ausblick Zusammenfassend lassen sich, ausgehend von der Zielsetzung dieser Arbeit, den Einfluss unterschiedlicher Temperaturführungen beim Maischverfahren auf die Flokkulation der Hefe zu untersuchen, zwei zentrale Fragen erfolgreich beantworten. Es konnte erstens bestätigt werden, dass der miniaturisierte Fermentationstest nach Lake et al. [46] geeignet ist, auch bei unterschiedlicher Würzezusammensetzung, erfolg- reich PYF-positive Malze von PYF-negativen zu unterscheiden. Zum Messzeitpunkt t=48h konnten dabei statistisch signifikant niedrigere Trübungswerte in den PYF- positiven Würzen nachgewiesen werden, nur beim Hochkurz-Maischverfahren wurde das Konfidenzniveau von 95 % knapp verfehlt und lag hier bei 93,7%. Eine Abweichung von diesem Muster wurde beim durchgeführten Vergleichstest festgestellt. Die Würze wurde bei diesem Test ebenfalls mit dem Hochkurz-Verfahren hergestellt, die Hefe wur- de aber in Malzextrakt anstatt in YEPD propagiert. Zum Messzeitpunkt t=48 h wurde hier eine stärkere Flokkulation der Hefe in PYF-negativem Malz beobachtet. Dies ließe sich z.B. mit besserer Adaption der Hefe an das Fermentationsmedium erklären, jedoch bleiben Fragen offen, da bei der Bestimmung von β-Glucan und pH-Wert ungeklärte Abweichungen von den Werten der anderen Maischverfahren auftraten. Zweitens konnte nachgewiesen werden, dass die Temperaturführung beim Maischpro- zess, und damit die Zusammensetzung der Würze, einen Einfluss auf die Intensität der Flockenbildung von Hefe ausüben kann. Es wurden zwei Ansätze zur Ermittlung von Kennzahlen erarbeitet, mit denen Unterschiede der Hefeflokkulation in PYF-negativer und PYF-negativer Würze quantifizierbar waren. Ein Kennwert zum Vergleich der In- tensität der Hefeflokkulation der beiden Malztypen wurde durch numerische Integration der Messwerte für die Würzetrübung im Fermentationsversuch und anschließender Bil- dung des Quotienten der beiden Integrale aus PYF-negativem zu PYF-positivem Malz berechnet. Bei diesem Ansatz ergaben sich für das Isotherme 65◦C-, das Hochkurz-, das Hochzucker-, das 45◦C- und das Eyben-Maischverfahren die höchsten Werte, al- so insgesamt die größten Unterschiede in den Messwerten der Würzetrübung zwischen PYF-negativem und PYF-positivem Malz. Um zu untersuchen inwieweit die verschie- denen Maischverfahren eine frühzeitige Flokkulation der Hefe auslösen können, wurden die Zeiten maximaler Würzetrübung ermittelt und die Zeitdauer berechnet, die im Er- reichen dieser maximalen Würzetrübung zwischen PYF-negativem und PYF-positivem - 39 - 5 Schlussfolgerung und Ausblick Malz bestand. Dabei erfolgte die Flockenbildung in PYF-positiver Würze aus der 45◦- Maische mit 7 h, der Eyben-Maische mit 8 h und der 35◦-Maische mit 9 h früher als in der jeweiligen PYF-negativen Würze. Bei den übrigen Maischverfahren lag die ermit- telte zeitliche Differenz zwischen -2 bis +2 Stunden und kann damit im Rahmen der Abstände der Probennahme nicht als signifikant betrachtet werden. Im Fazit können das 45◦C-Maischverfahren und das Eyben-Maischverfahren als die beiden Maischverfahren identifiziert werden, bei denen im vorliegenden Datensatz der Unterschied in der Flockenbildung zwischen PYF-negativem und PYF-positivem Malz am stärksten hervortritt. Zu bemerken ist, dass der Fermentationstest mit dem Maischverfahren nach Lake et al., das für die vorliegende Arbeit als Referenzverfahren verwendet wurde, nur eine vergleichsweise schwache Unterscheidung zwischen PYF-negativem und PYF-positivem Malz erlaubte. Lediglich die Mittelwerte der Trübungsmessungen der Würze liegen in PYF-positivem Malz bei t=48 h und t=72 h statistisch signifikant niedriger als in PYF- negativem Malz. Weder ein signifikant früheres Einsetzen der Hefeflokkulation aufgrund des Zeitpunkts der maximalen Würzetrübung, noch ein deutlicher Unterschied im Fer- mentationsverlauf der beiden Malzsorten (berechnet aus den Integralen der Verläufe der Fermentationen) war für dieses Maischverfahren nachweisbar. Die Auswertung der Daten der Begleitanalysen lässt für die Messwerte von β-Glucan und pH-Wert eine eindeutige Korrelation mit dem Malztyp erkennen. Die pH-Werte von Würzen aus PYF-positivem Malz liegen systematisch um 0,13 bis 0,27 Punkte niedriger als diejenigen aus PYF-negativem Malz, woraus ein direkter Zusammenhang zu stär- kerer Flockenbildung von Hefe in PYF-positiver Würze hergestellt werden kann [57]. Bei den Analysen für β-Glucan liegen die Werte für Würzen aus PYF-positivem Malz, mit einer Ausnahme, systematisch um etwa 150 bis 200 mg/l höher als in den Würzen aus PYF-negativem Malz. Aus der Fachliteratur sind Untersuchungen zum Einfluss des Gehalts an β-Glucan auf die Flockenbildung von Hefe nicht bekannt, hier bieten sich möglicherweise Ansatzpunkte zur weiteren Bearbeitung des Themenkomplexes an. Mutmaßlich kam es bei der spektrometrischen Messung der Arabinoxylan-Gehalte nach der Methode aus [55] zur Interferenz durch unvollständig vergorene Stärke und Sechsfachzucker (frdl. mündl. Mitt. Dr. rer. nat. Michael Kupetz). Zwar konnten teil- weise für Bierwürze plausible Werte gewonnen werden, gleichzeitig kam es aber auch zu niedrigen bzw. negativen Werten und nicht nachvollziehbaren Abweichungen zwischen - 40 - 5 Schlussfolgerung und Ausblick identischen Proben, die eine sinnvolle Auswertung unmöglich machten. Auch durch eine zweite Zugabe von Hefe (Saccharomyces diastaticus) und weiterer Nachgärung brachte in einer Wiederholungsmessung keine Verbesserung dieser inkonsistenten Ergebnisse. Damit entzieht sich auch in dieser Arbeit die Frage nach dem Zusammenhang zwi- schen einem bislang nicht näher identifizierten PYF-Faktor [7, 31, 36, 38, 39, 43] und dem Gehalt an Arabinoxylan in PYF-positiven Proben einer definierbaren Antwort. Da jedoch ein Zusammenhang zwischen den Arabinoxylan-Gehalten und dem Phänomen PYF vermutet wird, wäre es hier für Folgeuntersuchungen lohnenswert, die Bedingun- gen der Würzeherstellung apparativ noch genauer zu kontrollieren. In der vorliegenden Untersuchung könnte es möglicherweise bei der offenen Kochung im Maischbecher zu Unterschieden im thermischen Eintrag, der Bildung von Maillard-Produkten und der Trubausfällung gekommen sein. Diesen Einflüsse wäre beispielsweise durch Einstellung des Extraktgehaltes vor der Kochung und geschlossener Kochung im Wasserbad mit Rückführung der Brüden zu begegnen. Um Interferenzen bei der Messung durch Stär- ke zu begegnen, müsste weiterhin das Anstellen mit Saccharomyces diastaticus unter Bedingungen erfolgen, die eine Kontamination mit möglicherweise Arabinoxylan umset- zenden Mikroorganismen ausschließen, also z.B. mit einer steril propagierten, frischen Hefekultur und Beimpfung der frisch autoklavierten Würzen unter der Sterilbank. Grundlegende Überlegungen sollten zur experimentellen Durchführung eines Fer- mentationstests zur Ermittlung von PYF angestellt werden. Der Nachweis von PYF- positivem Malz konnte zwar in fast allen Experimenten geführt werden, jedoch wurden auch Probleme deutlich, die sich durch die Miniaturisierung des Versuchsaufbaus erga- ben. So könnte über eine Vergrößerung des Probenvolumens etwa auf 30 ml pro Reagenz- glas nachgedacht werden. Damit würden kaum evaluierbare Effekte wie unterschiedliche Gärvolumina nach Entnahme unterschiedlicher Probenvolumina aufgrund von Schaum- bildung abgemildert werden. Auch bei einer Erhöhung des Probenvolumens auf 30ml pro Reagenzglas könnten sich die Tests ohne wesentliche Erhöhung von Arbeitsaufwand und Probenmaterial im Labormaßstab durchführen lassen. Ein weiterer Punkt, den man bei der Diskussion um die Methodik anführen muss, ist das Propagationsmedium der Hefe. Der in dieser Arbeit durchgeführte Vergleichsversuch mit dem Hochkurz-Maischverfahren, bei dem die Anstellhefe in Malzextrakt propagiert wurde, konnte nicht erfolgreich zwischen den beiden Malzsorten unterscheiden. Inwie- fern sich dieses Ergebnis durch Parameter während der Würzebereitung erklären lässt, - 41 - 5 Schlussfolgerung und Ausblick oder durch die unterschiedliche Hefepropagation bedingt ist, ließ sich mit dem vorlie- genden Datensatz nicht abschließend klären, jedoch wären im Sinne der Annäherung der Testbedingungen an die Praxis hier jedoch weitergehende Untersuchungen sinnvoll. Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnte die Arbeitshypothese bestätigt werden, dass die Würzezusammensetzung konkreten Einfluss auf das Ausmaß und den Zeit- punkt der Hefeflokkulation hat. Bei der Herstellung von Würze findet aber ein komple- xes Zusammenspiel und ein Wechselwirken vieler verschiedener Enzymgruppen statt, was sich auch in der großen Streuung zwischen einigen der gemessenen Würzeparame- ter widerspiegelt. Eine Reduktion der möglichen Einflussparameter auf die Flokkulation wäre hier von Vorteil. Um die Rolle einzelner Substanzen auf die Flockenbildung der Hefe zu beleuchten, könnten die Fermentationsversuche mit einem Medium einfach zu reproduzierender Zusammensetzung durchgeführt werden, als einfach erhältliches Me- dium würde sich etwa Malzextrakt anbieten. Durch definierte Anreicherung könnte so ein direkter Einfluss der jeweiligen Substanz auf die Flockenbildung untersucht wer- den. Als Potentielle Parameter für entsprechende Test lassen sich Arabinoxylan, freier Aminostickstoff und pH-Wert Absenkung durch Würzesäuerung benennen. Abschließend kann als Empfehlung für die Brauereipraxis nach gegenwärtigem Kennt- nisstand eine Beibehaltung bereits gebräuchlicher Verfahren wie dem Hochkurz-Maisch- verfahren gegeben werden. Das 45◦C- und das Eyben-Maischverfahren stellen sich dage- gen aus Sicht der Ergebnisse dieser Arbeit als kontraproduktiv für die Praxisverwendung dar, da bei diesen Verfahren der PYF-Effekt in den Fermentationstests am stärksten hervorgerufen wurde. - 42 - 5 Schlussfolgerung und Ausblick 6 Literatur [1] Stewart, G. G. Brewing and Distilling Yeasts. Cham, Schweiz: Springer, 2017. [2] Thiele, Frithjof, Schneeberger, Mark und Back, Werner. „Physiologischer Zustand von Hefeproben aus verschiedenen Brauereien“. In: Brauwelt 470.18–19 (2007), S. 470–473. [3] Stewart, G. G., Hill, A. E. und Russell, I. „125th anniversary review — Deve- lopments in brewing and distilling yeast strains“. In: Journal of the Institute of Brewing 119 (2013), S. 202–220. [4] Stewart, G. G. „High gravity brewing and distilling - Past experiences and future prospects“. In: Journal of the American Society of Brewing Chemists 68 (2010), S. 1–9. [5] Annemüller, G., Manger, H.J. und Lietz, P. 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In: The Brewer International 2 (2002), S. 27–30. - 48 - 6 Literatur Tabelle 7.1: Trübungsmessungen der Fermentationsversuche, alle Werte gemessen bei 600 nm 72h 0,67 0,64 0,70 0,63 0,69 0,66 0,62 0,69 0,66 0,52 0,53 0,50 0,53 0,46 0,50 0,53 0,50 0,49 0,44 0,49 0,60 0,42 0,40 0,40 0,40 0,37 0,38 0,43 0,45 0,70 0,40 0,37 0,45 0,42 0,44 0,52 7 Anhang 7 Anhang Maische Malz Glas t=0h 12h 24h 30h 1,59 1,34 0,90 0,76 2,44 2,03 1,09 0,86 1,21 1,01 1,02 0,89 1,90 1,31 1,52 1,03 1,48 1,08 1,32 0,80 0,98 0,64 1,21 0,69 1,12 0,72 1,08 0,64 0,99 0,71 1,15 0,71 0,75 0,64 0,94 0,67 2,41 2,13 2,14 1,68 1,00 1,09 1,19 0,85 0,89 0,55 1,72 1,52 2,49 2,03 2,14 1,88 1,74 1,73 1,51 1,36 0,87 0,70 1,92 1,84 1,12 1,11 1,20 1,11 1,64 1,73 1,01 0,86 1,16 1,23 1,19 1,22 36h 48h 1,37 0,77 0,99 0,72 1,48 1,18 1,05 0,68 0,95 0,70 0,89 0,73 1,50 0,79 0,84 0,64 0,91 0,62 1,06 0,49 0,69 0,47 0,86 0,48 0,89 0,47 0,60 0,42 0,72 0,52 0,66 0,46 0,85 0,49 0,86 0,46 1,50 0,76 1,20 0,72 0,71 0,73 0,59 0,46 0,52 0,42 0,99 0,46 1,26 0,53 1,24 0,48 1,14 0,44 1,02 0,66 0,55 0,51 1,43 0,90 0,90 0,60 0,99 0,63 1,20 0,78 0,94 0,66 1,78 1,50 1,24 0,95 I65 negativ I65 negativ I65 negativ I65 negativ I65 negativ I65 negativ I65 negativ I65 negativ I65 negativ I65 positiv I65 positiv I65 positiv I65 positiv I65 positiv I65 positiv I65 positiv I65 positiv I65 positiv HK-M negativ HK-M negativ HK-M negativ HK-M negativ HK-M negativ HK-M negativ HK-M negativ HK-M negativ HK-M negativ HK-M positiv HK-M positiv HK-M positiv HK-M positiv HK-M positiv HK-M positiv HK-M positiv HK-M positiv HK-M positiv Neg-I-A Neg-I-B Neg-I-C Neg-II-A Neg-II-B Neg-II-C Neg-III-A Neg-III-B Neg-III-C Pos-I-A Pos-I-B Pos-I-C Pos-II-A Pos-II-B Pos-II-C Pos-III-A Pos-III-B Pos-III-C Neg-I-A Neg-I-B Neg-I-C Neg-II-A Neg-II-B Neg-II-C Neg-III-A Neg-III-B Neg-III-C Pos-I-A Pos-I-B Pos-I-C Pos-II-A Pos-II-B Pos-II-C Pos-III-A Pos-III-B Pos-III-C 0,83 2,01 0,83 1,49 0,83 2,15 0,93 1,69 0,93 1,73 0,93 1,24 0,93 2,45 0,93 2,02 0,93 2,18 0,87 1,70 0,87 1,67 0,87 2,39 0,89 1,70 0,89 1,97 0,89 1,41 0,88 1,64 0,88 0,95 0,88 1,82 0,65 1,45 0,65 1,36 0,65 1,35 0,69 1,11 0,69 1,41 0,69 1,33 0,65 1,41 0,65 1,35 0,65 1,25 0,81 1,41 0,81 1,39 0,81 1,43 0,65 1,11 0,65 1,25 0,65 1,13 0,66 0,97 0,66 1,06 0,66 1,06 - 49 - HK negativ HK negativ HK negativ HK negativ HK negativ HK negativ HK negativ HK negativ HK negativ HK positiv HK positiv HK positiv HK positiv HK positiv HK positiv HK positiv HK positiv HK positiv HZ negativ HZ negativ HZ negativ HZ negativ HZ negativ HZ negativ HZ negativ HZ negativ HZ negativ HZ positiv HZ positiv HZ positiv HZ positiv HZ positiv HZ positiv HZ positiv HZ positiv HZ positiv Neg-I-A Neg-I-B Neg-I-C Neg-II-A Neg-II-B Neg-II-C Neg-III-A Neg-III-B Neg-III-C Pos-I-A Pos-I-B Pos-I-C Pos-II-A Pos-II-B Pos-II-C Pos-III-A Pos-III-B Pos-III-C Neg-I-A Neg-I-B Neg-I-C Neg-II-A Neg-II-B Neg-II-C Neg-III-A Neg-III-B Neg-III-C Pos-I-A Pos-I-B Pos-I-C Pos-II-A Pos-II-B Pos-II-C Pos-III-A Pos-III-B Pos-III-C 0,85 1,34 1,27 0,85 1,45 2,12 0,85 0,96 1,12 0,68 1,34 1,19 0,68 1,42 2,37 0,68 1,10 1,44 0,89 0,88 0,59 0,89 0,91 1,10 0,89 0,80 0,82 0,90 0,99 1,22 0,90 0,90 0,96 0,90 0,85 0,57 0,91 1,55 2,64 0,91 0,93 0,77 0,91 0,82 0,87 0,90 0,94 2,22 0,90 0,84 0,97 0,90 1,21 1,21 0,67 1,54 1,46 0,67 1,53 1,63 0,67 1,50 1,38 0,73 1,31 1,23 0,73 1,68 2,18 0,73 1,38 1,18 0,72 1,19 0,88 0,72 1,09 0,93 0,72 1,35 1,21 0,64 1,40 1,27 0,64 1,45 1,36 0,64 0,92 0,67 0,66 1,30 0,98 0,66 1,26 1,02 0,66 1,20 0,86 0,65 0,75 0,53 0,65 1,53 1,76 0,65 1,34 1,07 7 Anhang Maische Malz Glas t=0h 12h 24h 30h 36h 0,98 0,76 1,95 1,68 1,09 1,08 1,05 1,21 2,43 2,41 1,64 1,71 0,52 0,53 1,14 0,98 0,72 0,61 1,20 1,09 0,78 0,69 0,59 0,52 2,81 2,41 0,66 0,55 0,77 0,74 1,90 1,16 0,86 0,59 0,96 0,77 1,24 1,04 1,52 1,18 1,29 1,09 1,06 0,89 1,84 1,30 1,04 0,90 0,82 0,75 0,83 0,78 1,10 0,90 0,91 0,63 0,90 0,60 0,53 0,47 0,74 0,56 0,75 0,57 0,71 0,55 0,51 0,50 1,06 0,62 0,80 0,58 48h 72h 0,67 0,72 1,09 0,80 0,86 0,82 1,11 1,25 2,61 1,16 1,81 1,42 0,55 0,47 0,80 0,62 0,62 0,56 0,67 0,50 0,54 0,48 0,52 0,53 1,18 0,60 0,54 0,51 0,54 0,47 0,56 0,42 0,53 0,45 0,57 0,42 0,77 0,68 0,86 0,69 0,82 0,64 0,74 0,74 1,07 0,80 0,72 0,65 0,71 0,72 0,74 0,69 0,70 0,65 0,48 0,46 0,48 0,42 0,47 0,46 0,48 0,46 0,47 0,46 0,48 0,46 0,48 0,50 0,44 0,40 0,47 0,45 - 50 - E35 negativ E35 negativ E35 negativ E35 negativ E35 negativ E35 negativ E35 negativ E35 negativ E35 negativ E35 positiv E35 positiv E35 positiv E35 positiv E35 positiv E35 positiv E35 positiv E35 positiv E35 positiv E45 negativ E45 negativ E45 negativ E45 negativ E45 negativ E45 negativ E45 negativ E45 negativ E45 negativ E45 positiv E45 positiv E45 positiv E45 positiv E45 positiv E45 positiv E45 positiv E45 positiv E45 positiv Neg-I-A Neg-I-B Neg-I-C Neg-II-A Neg-II-B Neg-II-C Neg-III-A Neg-III-B Neg-III-C Pos-I-A Pos-I-B Pos-I-C Pos-II-A Pos-II-B Pos-II-C Pos-III-A Pos-III-B Pos-III-C Neg-I-A Neg-I-B Neg-I-C Neg-II-A Neg-II-B Neg-II-C Neg-III-A Neg-III-B Neg-III-C Pos-I-A Pos-I-B Pos-I-C Pos-II-A Pos-II-B Pos-II-C Pos-III-A Pos-III-B Pos-III-C 1,14 1,40 1,14 0,80 1,14 0,79 0,83 1,11 0,83 0,78 0,83 1,12 0,89 0,96 0,89 1,37 0,89 0,82 0,93 1,08 0,93 0,96 0,93 1,07 0,82 1,45 0,82 0,94 0,82 0,95 1,24 0,98 1,24 0,90 1,24 0,84 1,07 0,99 1,07 0,97 1,07 0,79 0,88 1,39 0,88 1,72 0,88 1,13 0,84 1,94 0,84 1,12 0,84 1,51 0,89 1,48 0,89 1,23 0,89 0,74 0,82 0,89 0,82 1,72 0,82 1,25 1,02 1,10 1,02 0,76 1,02 0,78 7 Anhang Maische Malz Glas t=0h 12h 24h 30h 1,03 0,99 0,80 0,71 0,72 0,75 1,16 0,87 0,62 0,69 0,95 0,80 0,69 0,63 1,32 1,26 0,82 0,71 0,72 0,59 0,60 0,57 0,67 0,62 0,99 0,85 0,74 0,63 0,84 0,68 0,68 0,55 0,59 0,61 0,90 0,65 0,80 0,70 0,64 0,63 0,66 0,66 1,30 1,21 1,16 1,00 0,98 0,89 2,12 1,51 1,65 1,26 2,23 1,89 0,83 0,72 0,82 0,61 0,73 0,63 0,57 0,52 1,46 0,96 1,22 0,90 0,68 0,57 0,54 0,55 0,54 0,52 36h 48h 72h 0,83 0,73 0,74 0,69 0,69 0,70 0,71 0,72 0,74 0,74 0,62 0,60 0,66 0,62 0,64 0,73 0,67 0,63 0,67 0,62 0,65 1,01 0,72 0,62 0,70 0,70 0,68 0,58 0,59 0,55 0,57 0,62 0,58 0,58 0,60 0,59 0,70 0,63 0,64 0,62 0,58 0,65 0,69 0,62 0,65 0,58 0,57 0,59 0,58 0,60 0,62 0,72 0,65 0,76 0,70 0,70 0,71 0,62 0,62 0,64 0,61 0,66 0,68 0,86 0,73 0,72 0,94 0,70 0,67 0,78 0,72 0,68 1,14 0,75 0,66 0,81 0,77 0,69 1,17 0,75 0,73 0,65 0,61 0,61 0,60 0,59 0,62 0,58 0,56 0,58 0,57 0,56 0,55 0,68 0,61 0,59 0,69 0,59 0,59 0,54 0,55 0,62 0,55 0,52 0,54 0,55 0,53 0,57 - 51 - Eyben negativ Eyben negativ Eyben negativ Eyben negativ Eyben negativ Eyben negativ Eyben negativ Eyben negativ Eyben negativ Eyben positiv Eyben positiv Eyben positiv Eyben positiv Eyben positiv Eyben positiv Eyben positiv Eyben positiv Eyben positiv LuS negativ LuS negativ LuS negativ LuS negativ LuS negativ LuS negativ LuS negativ LuS negativ LuS negativ LuS positiv LuS positiv LuS positiv LuS positiv LuS positiv LuS positiv LuS positiv LuS positiv LuS positiv Neg-I-A Neg-I-B Neg-I-C Neg-II-A Neg-II-B Neg-II-C Neg-III-A Neg-III-B Neg-III-C Pos-I-A Pos-I-B Pos-I-C Pos-II-A Pos-II-B Pos-II-C Pos-III-A Pos-III-B Pos-III-C Neg-I-A Neg-I-B Neg-I-C Neg-II-A Neg-II-B Neg-II-C Neg-III-A Neg-III-B Neg-III-C Pos-I-A Pos-I-B Pos-I-C Pos-II-A Pos-II-B Pos-II-C Pos-III-A Pos-III-B Pos-III-C 0,95 1,33 0,95 1,64 0,95 1,58 0,87 0,85 0,87 1,36 0,87 0,85 0,71 1,39 0,71 1,16 0,71 0,76 0,83 0,79 0,83 0,76 0,83 1,10 0,60 1,15 0,60 0,75 0,60 0,70 0,64 1,29 0,64 1,34 0,64 0,93 0,78 1,00 0,78 1,39 0,78 1,40 0,80 1,10 0,80 1,14 0,80 1,50 0,78 1,05 0,78 1,14 0,78 0,96 0,75 1,01 0,75 1,08 0,75 1,47 0,77 1,51 0,77 1,49 0,77 1,05 0,74 0,99 0,74 1,54 0,74 0,96 7 Anhang Maische Malz Glas t=0h 12h 24h 30h 1,63 1,38 2,80 2,44 2,88 2,59 0,92 0,83 1,48 1,33 1,19 1,02 0,68 0,64 1,34 1,36 0,82 0,73 0,66 0,54 0,62 0,66 1,38 1,17 1,05 0,75 0,52 0,58 0,57 0,56 0,70 0,62 1,53 1,43 0,94 1,31 1,09 1,06 1,39 1,24 1,44 1,26 0,98 0,95 0,95 0,83 1,40 0,93 0,70 0,67 1,04 0,92 1,03 0,89 0,61 0,57 0,66 0,59 1,80 1,23 1,74 1,48 1,68 1,21 1,13 1,16 0,63 0,62 1,92 1,43 1,40 1,06 36h 48h 72h 1,01 0,74 0,58 1,97 1,07 0,72 2,01 1,80 0,86 0,76 0,64 0,60 1,17 0,85 0,60 0,86 0,72 0,60 0,64 0,60 0,60 1,28 0,98 0,57 0,70 0,65 0,56 0,53 0,48 0,49 0,64 0,66 0,47 0,99 0,60 0,46 0,53 0,47 0,44 0,51 0,48 0,46 0,49 0,49 0,46 0,53 0,45 0,42 1,15 0,53 0,39 1,18 0,73 0,42 0,94 0,87 0,72 1,03 0,76 0,60 1,18 0,79 0,61 0,90 0,74 0,60 0,79 0,72 0,63 0,84 0,68 0,68 0,71 0,68 0,72 0,90 0,70 0,62 0,84 0,72 0,66 0,53 0,53 0,46 0,61 0,52 0,48 0,83 0,56 0,47 0,96 0,67 0,54 0,87 0,58 0,60 0,91 0,65 0,57 0,61 0,54 0,52 0,91 0,56 0,47 0,85 0,60 0,48 - 52 - 7 Anhang AE 1.00 1.00 0.75 0.75 0.50 0.50 0.25 0.25 0.00 0.00 0204060 Zeit [h] 0204060 Zeit [h] BF 1.00 1.00 0.75 0.75 0.50 0.50 0.25 0.25 0.00 0.00 0204060 Zeit [h] 0204060 Zeit [h] CG 1.00 1.00 0.75 0.75 0.50 0.50 0.25 0.25 0.00 0.00 0204060 Zeit [h] 0204060 Zeit [h] DH 1.00 1.00 0.75 0.75 0.50 0.50 0.25 0.25 0.00 0.00 0204060 Zeit [h] 0204060 Zeit [h] Abbildung 7.1: Vergleich der Würzetrübung in PYF-negativen und PYF-positiven Würzen mittels t-Test. Dargestellt ist der ermittelte p-Wert des durchgeführten Mittel- wertvergleichs für alle Messzeitpunkte, rot markierte Punkte stehen für ein Signifikanz- niveau größer 95%. A: Isothermes 65◦C-Maischverfahren, B: Hochkurz-Maischverfahren (Anstellhefe in Malzextrakt propagiert), C: Hochkurz-Maischverfahren, D: Hochzucker- Maischverfahren, E: 35◦ C-Maischverfahren, F: 45◦ C-Maischverfahren, G: Eyben- Maischverfahren, H: Maischverfahren nach Lake et al. [46]. - 53 - p−Wert p−Wert p−Wert p−Wert p−Wert p−Wert p−Wert p−Wert 4,2 0,6 5,2 0,9 3,8 0,5 4,2 0,5 4,0 0,5 4,3 0,6 5,2 1,2 5,3 1,2 6,0 1,2 4,6 1,4 4,9 1,5 6,0 2,0 5,1 1,0 N/A N/A 5,0 1,0 5,1 1,0 4,9 0,9 5,6 1,0 5,0 0,8 4,1 0,6 4,9 0,8 4,7 0,7 4,9 0,7 5,0 0,7 3,3 49,4 10,8 5,9 55,5 18,6 3,6 48,3 10,7 2,5 47,9 14,6 2,2 48,3 14,2 2,2 49,9 15,6 1,5 50,4 15,2 1,6 52,1 15,5 1,8 68,0 20,0 2,5 54,2 11,5 2,8 56,7 11,8 2,9 64,3 13,8 3,0 55,4 11,8 N/A N/A N/A 3,5 58,6 12,3 1,9 56,8 16,5 1,5 53,9 15,3 2,0 58,7 16,4 4,4 57,8 12,7 4,1 51,0 11,9 4,0 51,9 12,6 2,5 49,7 16,1 2,4 50,8 15,5 2,3 49,7 15,4 7 Anhang Tabelle Maische I65 I65 I65 I65 I65 I65 HK-M HK-M HK-M HK-M HK-M HK-M

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HK
HK

HZ HZ HZ HZ HZ HZ 7.2: Analysen der Zuckergehalte der Würzen, Alle Zahlenangaben in [g/l] Würze PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III Glucose Fructose Saccharose Maltose Maltotriose - 54 - PYF-negativ-I 7,5 1,9 PYF-negativ-II 7,1 1,6 PYF-negativ-III 6,7 1,6 PYF-positiv-I 7,9 1,8 PYF-positiv-II 7,8 1,8 PYF-positiv-III 8,4 1,8 PYF-negativ-I 7,3 1,9 PYF-negativ-II 6,7 2,0 PYF-negativ-III 6,6 2,4 PYF-positiv-I 8,0 1,7 PYF-positiv-II 7,1 1,6 PYF-positiv-III 6,8 1,6 PYF-negativ-I 6,2 1,3 PYF-negativ-II 6,6 1,5 PYF-negativ-III 5,8 1,4 PYF-positiv-I 6,9 1,4 PYF-positiv-II 7,0 1,4 PYF-positiv-III 6,9 1,4 PYF-negativ-I 7,4 1,9 PYF-negativ-II 6,3 1,7 PYF-negativ-III 6,3 1,6 PYF-positiv-I 7,1 1,6 PYF-positiv-II 6,4 1,4 PYF-positiv-III 7,3 1,5 2,9 53,1 14,2 2,5 48,4 12,9 2,3 44,9 12,8 0,8 44,3 15,6 0,9 42,3 15,3 1,0 45,8 16,8 1,9 50,2 10,4 1,7 48,5 11,3 1,2 44,1 10,2 1,0 52,5 15,6 0,7 47,2 13,4 0,6 44,5 12,8 1,6 52,6 9,3 1,4 53,7 11,1 1,6 51,7 9,0 0,2 51,5 13,5 0,2 53,6 14,1 0,2 50,9 13,7 1,3 59,3 12,5 1,0 49,4 10,5 1,0 52,5 10,6 0,3 52,1 14,2 0,3 47,1 13,2 0,6 53,3 14,6 7 Anhang Maische E35 E35 E35 E35 E35 E35 E45 E45 E45 E45 E45 E45 Eyben Eyben Eyben Eyben Eyben Eyben LuS LuS LuS LuS LuS LuS Würze Glucose Fructose Saccharose Maltose Maltotriose - 55 - Tabelle 7.3: Analysen von FAN, löslichem Stickstoff und β-Glucan, Zahlenangaben für löslichen Stick- stoff und β-Glucan in [mg/l], Zahlenangaben für FAN in [mg/100ml]. 7 Anhang Würze I65 I65 I65 I65 I65 I65 HK-M HK-M HK-M HK-M HK-M HK-M

HK
HK
HK
HK
HK
HK

HZ HZ HZ HZ HZ HZ Malz PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III lösl. N

720
715
664
674
650
656
690
681
708
684
674
720
710
727
691
678
688
692
680
675
688
646
662
652

FAN β-Glucan 8,0 353 12,8 313 11,6 279 11,8 452 13,1 497 13,5 478 14,0 446 13,1 457 14,4 494 11,4 329 10,7 331 12,6 351 13,9 342 11,8 319 11,7 309 12,5 525 10,6 513 12,1 525 11,0 281 11,0 281 11,5 262 12,2 510 10,0 468 NA 466 - 56 - 7 Anhang Würze E35 E35 E35 E35 E35 E35 E45 E45 E45 E45 E45 E45 Eyben Eyben Eyben Eyben Eyben Eyben LuS LuS LuS LuS LuS LuS Malz PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III PYF-negativ-I PYF-negativ-II PYF-negativ-III PYF-positiv-I PYF-positiv-II PYF-positiv-III lösl. N

717
738
622
684
692
675
757
791
880
697
676
687
762
752
756
751
747
738
796
830
758
737
732
732

FAN β-Glucan 13,8 253 13,5 325 10,6 251 13,2 479 12,6 499 12,0 484 8,8 265 13,2 345 15,1 303 13,9 446 14,1 466 13,7 428 14,2 321 14,5 379 12,8 267 14,8 525 14,6 525 14,9 525 13,3 341 15,6 349 9,0 328 14,8 525 15,3 525 15,1 525 - 57 - AB 7 Anhang 8 7 6 5 4 60 50 I65 HK−M HK HZ E35 E45 Eyb LuS Maischverfahren und Malztyp I65 HK−M HK HZ E35 E45 Eyb LuS Maischverfahren und Malztyp Abbildung 7.2: Gehalte von Glucose und Maltose, getrennt nach Maischverfahren und Malztyp. A: Glucose, B: Maltose - 58 - Glucose [g/l] Maltose [g/l]